发酵工程碱性磷酸酶.ppt

碱性磷酸单酯酶，又称碱性磷酸酯酶，碱性磷酸酶 碱性磷酸酶广泛分布于原核及真核生物各组织中，一般存在于外周胞质中。 其用途一般有：①在用32P标记5’末端前去除DNA或RNA的5’磷酸。②去除DNA片段5’磷酸以防止质粒DNA连接和自身环化 最适温度37℃，最适PH10，对底物只有相对专一性，在碱性条件下水 解磷酸酯：单磷酸酯+水→醇+磷酸 实验目的 从枯草芽孢杆菌中分离提取碱性磷酸酶 学习透析法脱盐 进行酶活分析 实验材料 菌种：枯草芽孢杆菌 固体培养基： 牛肉膏 0 . 5 % , 蛋白胨 1% , Na Cl 0. 5 % , 琼脂 2 % , ( p H 值 7. 4) ; Tris培养基: 葡萄糖 0.4% , 酪蛋白水解物 0.1% , NaCl 0.5% , ( N H4) 2SO4 1% , KCl 0. 1% , CaCl 2 0. 1 mmol/ L, MgCl2 1 mmol/ L , Na2 HP O420 L mol / L, 溶解于 0. 1 mol/ L 的 Tr i s- HCl 缓冲液中( p H 值 7. 4)溶菌酶、蔗糖、EDTA、硫酸铵 三氯甲烷 4- 氨基安替比林( AAP) , 硫酸氢钠, 铁氰化钾, 硼酸, 磷酸苯二钠, CP，海藻酸钠（CA），CaCl2; 数显恒温水浴锅, 722 型分光光度计, 高速冷冻离心机, pHS - 2C 数字酸度计，碱性磷酸酶酶活测定试剂盒。 聚乙烯醇 实验原理 渗透压冲击法破裂细胞 分级盐析法提取碱性磷酸酶 透析法脱盐 酶活测定的原理 细胞培养与收集 活化菌种 种子液 摇瓶发酵 5000rmp 15min 收集菌体（每组约50ml发酵液） 渗透压冲击法破壁 倾尽培养基，加入7mL 0.1M Tris-HCl pH7.5缓冲液，1mL 1M MgCl2溶液，轻轻吹打菌体使其悬浮于上述溶液中，37℃振荡20min，5000rpm离心15min，上清液即为粗酶液。留取1mL粗酶液做酶活测定。 实验步骤 分级盐析 50％饱和度除杂蛋白：向其余粗酶液（约7mL）中慢慢加入研细的硫酸铵粉末至50％饱和度（边加边搅拌至硫酸铵溶解），室温下静置10min，5000rpm离心15min，弃沉淀； 不同饱和度（60%、70％、75%、80％、90％）沉淀目的物：向上清液中继续慢慢加入研细的硫酸铵粉末至相应的饱和度（边加边搅拌至硫酸铵溶解），室温下静置10min，5000rpm离心15min，保留沉淀。 透析除盐 用2mL 0.1M Tris-HCl 缓冲液溶解沉淀物，装入透析袋，两端扎紧，置于蒸馏水中透析一周，除去沉淀物中的硫酸铵。——纯酶液 测定酶活 碱性磷酸酶的活性是根据在一定的pH值和温度下,碱性磷酸酶作用于底物磷酸苯二钠, 使之水解释放出酚。酚在碱性溶液中与 4- 氨基氨替比林(AAP)作用并经铁氰化钾催化, 生成红色醌类化合物, 在 510nm 波长处比色测定, 利用下式计算出酶的活力。 酶活力( 单位) = v OD510 * 1000 = ( OD510反应后- OD510反应前) * 1000 分子量测定 SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)测定蛋白质纯度与分子量。 酶的 Km和Vmax 的测定 将底物(磷酸苯二钠)分别稀释成不同的浓度, 在 pH值 8.8, 加一定量酶液37℃保温 15 mi n进行酶促反应, 分别测定底物浓度为 2、4、6、8、16、20 mmol/ L 时的酶活力(即为反应速 度) , 将测定结果分别计算1/rS和1/CS，由LineweaverBurk作图法求出Km。以 1/rS为纵坐标,1/CS为横坐标作图, 由图求出最大反应速度Vmax。 酶的修饰（固定化） 取1g聚乙烯醇（PVA）置于10mL蒸馏水中，于80℃水浴30-60min，当用烧杯取溶解后液体在明亮处观察，溶液清亮，无可见透明颗粒。说明聚乙烯醇溶解已完全彻底，加入海藻酸钠（CA），80℃继续水浴配成聚乙烯醇PVA—海藻酸钠CA溶液用蒸馏水补足体积，冷却至室温，再加入碱性磷酸酶(ALP)溶液，配成酶与载体胶体，用上5.0mL的注射器注入到含4%CaCl2 的饱和硼酸溶液（pH6.7）中固定后，4℃下交联2h滤出固定化球体，然后用蒸馏水冲洗