发酵分析—高效液相色谱技术.ppt

高效液相色谱技术（High Performance Liquid Chromatography，HPLC） HPLC和经典液相色谱法的比较 高效液相色谱法的特点 （1）分离效能高：柱效可达5000~30000块/米 （2）选择性高：通过流动相的控制来改善分离过程的选择性 （3）检测灵敏度高： UV—最小检出量可以达到10-9 g FD--最小检出量可以达到10-12 g （4）分析速度快:采用了高压泵 结构流程 1、流动相和储液罐 （1）储液罐 ? 材质：玻璃、不锈钢、氟塑料或特种塑料聚醚醚酮（PEEK） 棕色玻璃瓶会避免藻类的生长 ? 容积：0.5~2.0L ? 放置位置：高于泵体，保持一定的输液静压差 ? 注意：密封、过滤 液相色谱的流动相 2. 流动相类别 3. 流动相选择 （2）流动相过滤 流动相过滤的目的 ? 过滤去除可能存在的微小固体颗粒 ? 保护色谱高压泵和色谱柱 流动相过滤方法 ? 在线溶剂过滤 ? 抽真空过滤 流动相 在线过滤： 流动相 抽真空过滤 流动相脱气的目的 使色谱泵的输液准确 输液均匀准确，并且脉动减小 保留时间及色谱峰面积的重现性提高 提高检测的性能 防止气泡引起的尖峰 基线稳定，信噪比增加 溶剂的紫外吸收本底降低 保护色谱柱 减少死体积 防止填料的氧化 常用的脱气方法有： 抽真空脱气法： 特点：可以一次完成过滤和脱气任务 注意：抽真空会引起混合溶剂组分的变化，适合单一溶剂体系 超声波脱气法 简单，但效果不理想 使用新鲜配制的流动相，特别是水溶剂或盐缓冲液建议不超过两天，最好每天更换 2、高压泵 双柱塞往复式串联泵示意图 四元低压梯度系统 四元高压梯度系统 六通阀进样装置 反面连接 自动进样器 三、分离系统-色谱柱 柱材料和规格 ﹠不锈钢管 ﹠柱管的内径：0.5 ～ 4.6mm ﹠填料粒度：3 ～ 10 μm ﹠柱长度：10 ～ 25 cm 常用色谱柱有： ODS柱、氰基柱、氨基柱等 液-固吸附分离固定相 （3）化学键合固定相 化学键合固定相的特点： 5、检测器 主要作用：监测经色谱柱分离后的组分浓度变化，并由工作站记录数据，定性、定量分析。 紫外-可见光检测器光路示意图 可变波长紫外检测器 ﹠ 选用氘灯作为光源，在190—600 nm 范围内可连续调节，选择不同的波长检测 b. 光电二极管阵列检测器（DAD） DAD检测器的主要特点 ①可以同时得到多个波长的色谱图，可以计算不同波长处的相对吸收比 ②可以在色谱分离同时，对色谱峰的指定位置实时记录吸收光谱图，并得到最大吸收波长 ③在色谱运行期间，可以逐点进行光谱扫描，得到时间—波长—吸收值为坐标的三维图形 三维：光谱-色谱图 c. 示差折光检测器（Differential refractive index detector） d. 荧光检测器（Fluorescence detector） 本章小结 色谱过程、分离原理及其分类；分配系数K TLC中 Rf 值的计算 SDS与琼脂糖凝胶电泳的基本原理及其适用范围。 气相色谱检测器的类型及适用范围。 HPLC正相与反相色谱的组成及其特点。 固定相：极性的有机基团，CN、NH2。双羟基等键合在硅胶表面 流动相：非极性或极性小的溶剂（如正已烷）中加入适量极性溶剂（如氯仿、醇等） 分离机理：范德华力、诱导力或氢键力 用途：多用于分离极性或中等极性化合物 正相键合相色谱法（NPBPC） 其它固定相 离子交换固定相：离子交换树脂、键合型离子交换树脂 空间排阻色谱固定相：凝胶 手性固定相：手性官能团键合或天然手性物质固着在载体上如环糊精 亲合色谱固定相：生物专一性配基+载体 紫外检测器 示差折光检测器 荧光检测器 光电二极管阵列检测器 a. 紫外检测器 基于被分析组分对特定波长紫外光或可见光的选择性吸收，应用最广，对大部分有机化合物有响应。 灵敏度高；线性范围宽；流通池可做得很小(1mm × 10mm ，容积 8μL)；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作； 可用于梯度洗脱。 紫外检测器的重要进展； 光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图。 除紫外检测器之外应用最多的检测器。 可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度成正比。 通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）。 灵敏度低，对温