实验三__聚丙烯酰胺凝胶电泳.ppt

（2）加液：向下电泳槽加入适量的硼酸-硼砂缓冲溶液，没过凝胶管的底部和电极，注意胶柱下方不要有气泡。 （3）加样：用胶头滴管吸取配好的样品液，沿管壁缓慢加在凝胶柱上边，加样量以凝胶管内样品液高度2~3mm为宜。加样枪不可插入过深，以免刺破凝胶，同时要缓慢、均匀，以免搅动缓冲液引起样品扩散。 （4）封液：用胶头滴管吸取电极缓冲液，沿管壁慢慢加入凝胶管上方至加满凝胶管，注意不要使缓冲液与样品液混在一起。 （5）然后向上电泳槽中加入电极缓冲液，使凝胶管的上端被缓冲液浸没，随后盖上电泳槽的槽盖。 （6）电泳：将上层电泳槽的电极接电泳仪的负极，下槽接电泳仪的正极，接通电源。调节电流为lmA／管，5min后，样品液被压缩成一薄层，调节电流为3mA／管。待示踪染料运动至凝胶管下端管口时(离管下口0.5cm)，切断电源，结束电泳（时间约为30~50min）。 4．剥胶：将上下电泳槽的缓冲液回收到试剂瓶中，取下凝胶管，以注射器吸取蒸馏水，用10cm长针头沿凝胶管壁插入胶柱与管壁之间，针头切面朝向凝胶管壁，从负极端紧贴管壁，边注水边进针，使胶柱与玻璃管松动，最终使凝胶柱从玻管中缓慢滑出。必要时用洗耳球在一端轻轻加压。(注入蒸馏水做润滑剂，针头螺旋式前进，缓缓剥离) 5．固定：12.5%三氯醋酸溶液，10min。 6．染色：考马斯亮蓝染液，60℃，10min。 7．脱色：脱色液，60℃，10min，直至底色基本褪去，可清晰的观察到10~20条蛋白质区带。 五、结果与分析： 经染色脱色后的胶柱，在日光下观察，至少可看到10~20条蛋白质着色区。从正极到负极依次为：白蛋白区、α1-球蛋白区、α2-球蛋白区、β-球蛋白区和γ-球蛋白区。 区带观察：1.排列顺序 2.区带宽窄 3.颜色深浅 前清蛋白 白蛋白 ?2-球蛋白 ?1-球蛋白 ?-球蛋白 ?-球蛋白 5~8条 3.5cm 18.5% 3~5条 1.5cm 8.8% 6~12条 2.5cm 7.4% 5~7条 1.0cm 3.11% 2~3条 0.5-0.8cm 62.6% 六、注意事项 1.丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺都是神经性毒剂，对皮肤有刺激作用、但在形成凝胶后则无毒，因此在形成凝胶之前应尽量注意避免直接接触。丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺溶液应装在棕色瓶中，用前检测pH值是否失效。失效液不能聚合。 2.配胶的时候要按照表的顺序加入，配好胶后应尽快灌胶，不要形成气泡，汽泡会影响电泳分离效果。 3.刚灌注分离胶混合溶液后，应立即在分离胶液面上加3~5mm高的水层，以阻隔空气。胶液面上加水及吸水，还有加样层时要特别小心，缓慢加入，以免冲坏凝胶的胶面。灌胶和电泳时要注意排气泡. 4．装槽装稳、直、平。电泳时凝胶管不能漏水，并且与电泳池垂直。切记装柱后应用蒸馏水密封. 5. 加速剂（TEMED）要密封保存，过硫酸溶液现配现用，防止氧化失效。 6．蛋白加样量要合适。加样量太少，条带不清晰；加样量太多则泳道超载，条带过宽而重叠，甚至覆盖至相邻泳道。加样时不能损伤凝胶表面. 7．剥胶宜小心，否则前功尽弃。 8. 电泳时凝胶管不能漏水，并且与电泳池垂直 9．固体切忌倒入水池。 * 这种分子筛效应与我们讲的层析中的分子筛效应是不同的，层析中会凝胶过滤层析法又称分子筛层析，主要是根据蛋白质的大小和形状进行分离和纯化。层析柱中的填料是惰性的多孔网状结构物质，小分子物质能进入这些网状结构内，流下来速度慢，而大分子物质却被排除在外部，只能在这些网状结构间运动，流下来的速度快， 配制溶液的时候要注意液体的准确量取，加速剂要最后加 * ，须缓慢细心，尽量减少胶液表面的震动，防止胶液面被破坏或水层与胶液的混合。水封的原因呢，一是防止分离胶溶液的氧化，二是为了胶面的平整，利于电泳在一条直线上。 * （凝胶元气泡、裂缝、剥离或无聚合不匀）上端能看到胶面，一定要插紧， * ，注意，针头的斜面对着凝胶管。 * 染料应浸没全部凝胶， * 实验三血清蛋白质聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳PolyAcrylamide Gel Electrophoresis(PAGE) 一、实验目的 1.掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理。 2.掌握聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳分离血清蛋白质的方法。 蛋白质的分离 蛋白质是生物大分子化合物，具有胶体性质、沉淀、变性和凝固等特点　蛋白质分离纯化的方法主要有：盐析、透析、超离心、电泳、离子交换层析、分子筛层析等方法。 电泳技术 电泳蛋白质在一定的pH溶液中可带有电荷，成为带电颗粒，在电场中向相反的电极方向泳动。由于蛋白质的分子量和电荷量不同，其在电场中的泳动速率也不