实验九_动物组织中DNA的提取与鉴定.ppt

实验九 动物组织中DNA的提取与鉴定 一、实验目的 掌握DNA的提取方法。 二、实验原理 DNA + RNA Pr Pr + DNP RNP DNP在1mol/L NaCl中溶解度最大 RNP在0.15mol/L NaCl中溶解度最大 可分离DNP和RNP 二苯胺 二苯胺法鉴定 DNA 酸解 脱氧核糖 嘌呤 ω-羟基-γ酮基戊醛 蓝色的化合物 SDS DNA Pr DNP 氯仿-异戊醇 除去蛋白质 95%的乙醇 沉淀 几个试剂的作用 柠檬酸盐、EDTA 防止DNA酶对DNA的降解 （可螯合除去DNA酶活性所需的Mg2+， 抑制DNA酶的活性） SDS 氯仿-异戊醇 除去变性蛋白质 使蛋白质变性 三、操作  1、制备匀浆： 称取新鲜动物肝脏5g，置于研钵中，剪碎，加2倍组织重的冷0.15mol/L?NaCl–0.015mol/L柠檬酸钠溶液(10mL)，研磨成浆状，得匀浆液。 （一）DNA的提取  2、抽提DNP粗制品 将匀浆液（除去组织碎片）转移至离心管中，4000r/min离心10min，弃去上清夜，收集沉淀(内含DNP)。向沉淀中加两倍体积(10mL)的冷0.15mol/L?NaCl–0.015?mol/L柠檬酸钠溶液，搅匀，如前离心，重复洗涤2~3次。所得沉淀为DNP粗制品，移至烧杯中。?  3、DNA与蛋白质分离 向沉淀中加入冷0.15?mol/LNaCl-0.1?mol/L??EDTA-Na2溶液，使总体积达到8mL，在缓慢搅拌的同时滴加5% SDS溶液2mL，使SDS最终浓度达 1%，边加边搅拌，使DNA与蛋白质分离。 再加入5mol/L NaCl溶液2.5mL，使NaCl最终浓度达1mol/L，搅拌10min（速度要慢），溶液变得黏稠并略带透明。  4、除蛋白质、糖等杂质 ? 最后加入等体积的冷氯仿-异戊醇混合液，搅拌20min，4000r/min离心10min，分层情况：上层为水相（含DNA钠盐），中层为变性的蛋白质沉淀，下层为氯仿-异戊醇混合液。 用吸管小心地吸取上层水相，弃去沉淀，再在相同条件下重复抽提2~3次。上清液（含DNA钠盐）用于做以下实验。  5、?沉淀DNA 取上清液5mL放入干燥的试管（小烧杯）中，加入2倍体积预冷的95%乙醇。加入时，用滴管吸取乙醇，边加边用玻璃棒慢慢顺一个方向在试管（烧杯）内转动，随着乙醇的不断加入可见溶液出现黏稠丝状物质，并能逐步缠绕于玻璃棒上，直至再无黏稠丝状物出现为止。黏稠丝状物即是DNA。  四、结果 （二）DNA的鉴定 用二苯胺法鉴定DNA。取上清液2mL于试管中，加入二苯胺试剂5mL，60－80℃加热15min，另外做一个空白对照：取2mL水于试管中，加入二苯胺试剂5mL，60－80℃加热15min，观察颜色。 2mL 上清夜 2mL 水 二苯胺试剂5mL, 60－80℃加热 颜色？ 颜色？ 15min （1）?0.15mol/L?NaCl?–?0.015mol/L?柠檬酸钠溶液（pH7.0）： 称取8.77g?NaCl，4.41g柠檬酸三钠（Na3C6H5O7?·?2H2O），用约800mL?蒸馏水溶解后，调节pH至7.0，最后定容至1?000 mL。 （2）?0.15mol/L?NaCl?–?0.1mol/L?EDTA-Na2溶液（pH8.0）： 称取8.77g?NaCl，37.2g?EDTA-Na2溶于800 mL蒸馏水中，以0.1 mol/L NaOH调pH至8.0，最后定容至1?000mL。 （3）?5mol/L?NaCl溶液：称取292.2 gNaCl溶于800 mL蒸馏水中，最后定容至1?000mL。 （4）5%SDS溶液（W/V）： 称取5g?SDS，溶于100mL的 45%（V/V）乙醇中。 （5）氯仿–?异戊醇溶液：按氯仿:异戊醇=24:1（V/V）配制。 （6）?95％（V/V）乙醇。 （7）二苯胺试剂： 称取1 g重结晶的二苯胺，溶于100mL冰醋酸（AR）中，再加入浓度不低于60% 的过氯酸（AR） 10mL ，混匀待用。临用前加入1mL 1.6%的乙醛溶液，配得试剂应为无色。 试剂和器材 1.试剂 （1）研钵 （2）离心机 （3）离心管 （4）手术剪 （5）吸管 （6）烧杯 （7）玻棒 （8）试管 （9）滴管 （10）新鲜动物肝脏 试剂和器材 2.器材