实验二 孚尔根核染色.ppt

实验2 洋葱根尖孚尔根染色法 实验目的 实验原理 实验方法 注意事项 实验作业 思考问题 实验目的 掌握孚尔根核染色的方法。 了解孚尔根染色的原理。 实验原理 Na2S2O3+ HCl→→亚硫酸根 亚硫酸根+碱性品红→无色的亚硫酸品红—Schiff试剂 DNA在60℃，1mol/L HCl作用下，核酸中的嘌呤碱很快完全除掉，脱氧核糖中潜在的的醛基获得自由状态，水解条件下形成半缩醛羟基，与Schiff试剂反应，形成紫红色化合物。 孚尔根核染色法是Feulgen和Rossonbek于1924年提出的鉴定细胞中DNA的组织化学方法。其优点是制片清洁、染色体清晰、组织软化好，易于压片。但对小型染色体（如玉米、水稻）效果较差。 实验方法 水洗：把已经固定好的洋葱根尖用50％乙醇和清水分别冲洗, 再把它放入室温的1mol/L HCl中处理2-3min。 将根尖换入60℃预热的HCl，置于恒温水浴中，在60?0.5℃的条件下水解10min。 吸出热HCl，换入室温1mol/L HCl再处理2min，然后水洗2-3次。 吸净水分，加入Schiff试剂，盖上盖子，黑暗条件下染色30min或过夜。 小心倒出Schiff试剂,然后用漂洗液洗3次。 漂洗液配置方法：取10ml10 %亚硫酸氢钠母液，加200ml蒸馏水，再加10ml1NHCL，即成漂洗液，使用前配置。 蒸馏水漂洗后取根尖置于载玻片上，只保留分生区，再加一滴45%的醋酸，压片镜检。 固定与固定液 固定：将新鲜的活组织从生物体取下后，立即投入固定剂中，借助化学药品的作用，使细胞保持原有形态结构的一种手段。 固定的目的 迅速防止细胞的死后变化，防止自溶、腐败，尽量保持生长状态结构。 使细胞中的蛋白质、脂肪、糖、酶等成分转变为不溶性物质，以保持生前状态。 使组织内各种物质成分产生不同的折射率，便于鉴定、观察。 使不同组织成分对染料有不同的亲和力，便于染色。 防止细胞过度收缩或膨胀，失去原有的形态结构。 预处理的目的及方法 目的：改变细胞质粘度，破坏和抑制纺锤体的形成，使染色体适度缩短和分散。 方法： 0.04-0.2%秋水仙素溶液2-4小时。 对二氯苯饱和溶液3-5小时。 0.002M (或0.03%)8-羟基喹啉1.5-2小时以上，室温。 低温：1-4℃处理24小时。 注意事项 Schiff试剂小心取放，及时清洗吸取Schiff试剂的吸管。 黑暗条件下染色。 实验作业 绘制你所观察到的图象，并说明是有丝分裂的哪一个时期，并注明放大倍数。 前期、中期、后期、末期 为什么要严格掌握DNA的水解条件？ 温度过低，时间过短：则DNA的水解不够彻底，醛基暴露不充分，染色会过浅。 温度过高，时间过长：则DNA过度水解，游离的核苷酸会漂移到细胞质中，造成染色浅或不均一 。 为什么要在实验材料从60℃盐酸中倒出后，再放入室温的盐酸中呢？ 为什么RNA在此过程中不会着色？ 由于在酸解条件下，RNA较DNA分子更加稳定，它的醛基难以游离，所以在用Schiff试剂染色时RNA分子不会着色。 * * 医 学 遗 传 学 实 验 HE XI UNIVERSITY 根冠 分生区 伸长区 成熟区 根尖形态与结构 材料从60℃的盐酸倒出后温度还相当高，如果直接转入Schiff试剂中，则会使Schiff试剂发生分解影响效果。所以我们首先要把材料转入室温的盐酸溶液中，做一个缓冲以避免Schiff 试剂分解。