CFSE标记细胞的影响因素探讨.pdf

维普资讯 第22卷第 5期 广 东 药 学 院 学 报 V01．22No．5 2006年 10月 JOURNALOFGUANGDONG COLLEGE OFPHARMACY Oct．2006 CFSE标记细胞的影响因素探讨 洪介民，黎庆梅 ，吕海峰，林之瑜 (暨南大学医学院第四附属医院／广州市红十字会医院 中心实验室，广东广州510220) 摘要：目的探讨影响CFSE标记细胞效果的多种因素。方法 用不同配制时间、不同浓度的CFSE标记不同浓度的 HL60细胞、 MCG803细胞 以及人淋巴细胞。结果 配制的CFSE在存放 2年 以后标记率下降 12．32％；在 10ixmol／L范围内细胞标记率与 CFSE浓度成正比；低浓度细胞的标记率比高浓度的更高；同等条件下HL60细胞的标记率高于MCG803细胞；细胞的异质性 使同一群细胞的标记率发生差异；散点图比直方图更适合 CFSE标记细胞的传代分析。结论 2．5～5ixmol／L的CFSE是理想 的标记浓度 ．10／mL是合适的标记细胞浓度 ，均一的细胞是高质量标记 的关键 。 关键词 ：CFSE；荧光染料 ；流式细胞术 ；细胞标记 中图分类号：R446．6 文献标识码 ：A 文章编号：1006—8783(2006)05—0541—03 2羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯 (5，6一 进行分装，一18cC保存，使用时以含P：0．1％BSA carboxyfluorescein diacetate succinimidylester，CFSE 的PBS稀释至所需浓度 。标记时将单细胞悬液加 或 CFDA．SE)是一种可穿过细胞膜 、自动而且不可 入 CFSE染液中，混匀后 37cC孵育 10min，用 1／4 逆地与胞内蛋白和膜表面蛋 白结合的荧光染料 。当 体积的冷新生牛血清终止标记，洗涤2次除去剩余 细胞分裂时，CFSE标记荧光可平均分配至2个子代 的染料，进行流式细胞术测定，或进行细胞培养 。 细胞中，是理想的活细胞荧光标记物。但 已有报道 1．4 标记细胞的检测 显示 CFSE标记细胞的方法差异较大，标记 的浓度 以未进行CFSE标记的细胞为阴性对照，在流式 不等 0]。在使用过程 中发现有许多 因素干扰 细胞仪上以488nm激发荧光，在525Bin带通滤镜进行 CFSE的标记和示踪，为此笔者对其中主要的影响因 CFSE标记的测定。以前向散射角(FSC)和侧向散射角 素作一探讨。 (ssc)设门，选定检测的细胞，以SSC和 CFSE观察细 胞的染色。其它的多荧光标记和测定按常规进行。 1 材料与方法 2 结 果 1．1 仪器与试剂 流式细胞仪：BD公司生产，FacsCalibur型，双激 2．1 荧光染料的影响 光配置 ；CFSE：MolecularProbes公司产品 (产品号 染料配制时间与保持对标记有影响。新鲜配制 C1157)；标定荧光微球、CD3．PE：BD公司产品；1640 的CFSE对同一种细胞有很高标记率，相同的细胞和 培养液、新生牛血清 ：Gibaco公司生产 ；BSA：Sigma 相同的CFSE浓度 ，试剂配制l0个月和2年后细胞荧 产品；淋巴细胞分离液：上海试剂二厂生产。 光标记强度由649道分别下降到630道和569道，下 1．2 细胞 降率为3％和 12．32％，但标记率仍比较满意(图1)。 白血病细胞株HL60、胃癌细胞株MCG803由中 2．2 细胞浓度和细胞种类的影响 山大学动物实验中心提供；志愿者提供全血以供分 同样 的HL60细胞株，在细胞浓度不同时标记 离淋巴细胞。