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两种分离模式的比较：亲水相互作用色谱 HILIC 与反反相色谱 ANP Joseph Pesek ，Maria T. Matyska Department of Chemistry, San Jose State University, San Jose, California Please direct correspondence to Joseph Pesek at pesek@sjsu.edu 在文献（1）及其他很多文献中，经常可以看到两种相似的色谱分离机理的色谱柱，一种是 亲水相互作用色谱（hydrophilic interaction liquid chromatography，HILIC），另外一 种是水相正相色谱（aqueous normal phase，ANP，也称反反相色谱）。但是，事实上这两种 色谱柱在保留模式上是不一样的。 本文旨在对 HILIC和 ANP色谱机理做一个准确的定义并 对何时使用哪种色谱柱做一个明确的指导。 实验部分 实验所使用的色谱柱为 UDC Cholesterol（75mm×4.6mm）及 Bidentate C18（BD C18，150 mm×4.6 mm或 20 mm×2.0 mm）来自于 MicroSolv Technology （Eatontown，New Jersey）。 流动相中的乙腈来自于 BJ（Muskegon，Michigan），水使用来自 Milli-Q仪器（Millipore， Bedford，Massachusetts）。甲酸购自 Spectrum Chemical（Gardena，California）。HPLC 为安捷伦 1050 型，配有自动进样器和二极管阵列检测器（Wilmington，Delaware）。样品 浓度范围为 0.1-1mg/mL，进样量为 1-5μL。反反相实验中的流动相含有 0.1%甲酸。 结果与讨论 HILIC: 亲水色谱是专为保留和分离极性-离子型化合物所设计的一类色谱柱。 在反相色谱 中极性-离子型化合物是在死体积附近被洗脱的，即不在反相柱上保留，所以对此类物质的 分析是很困难的。在反相色谱上开发方法时，很重要的需求就是物质要在固定相上有保留， 并且防止/减少硅胶表面硅羟基对化合物的吸附。为了使极性-离子型化合物能在反相柱上保 留，我们经常会对化合物进行衍生（2）或使用离子对试剂（3）。在前一种方法中需要将极 性-离子型化合物化学衍生为疏水性物质，而在后一种方法中则在流动相中加入带相反电荷 的物质，使极性-离子型化合物变为中性物质。这两种技术不但比较繁琐和费时，特别是离 子对技术会导致反相色谱不能与质谱（MS）及光散射检测联用，对实验造成很大限制。 最近发展出来的硅胶制造技术可以使得固定相更适合极性化合物的保留（1）。硅羟基能在 一定流动相条件下对极性化合物产生保留。另外一种方法就是对硅胶表面进行化学修饰，如 图 1 所示。 图 1：硅胶表面的化学修饰 如果 R 基团具有极性，如氰基（-CN），氨基（-NH ） 或二醇（-CH(OH)-CH-OH），这样固 2 2 定相就具有保留亲水化合物的能力。使用前一种典型的 HILIC 柱对极性化合物的保留性质如 图 2a 所示。 在低有机相比例（高水相比例）时，亲水性化合物没有保留，因为亲水化合物 更倾向于留在流动相中。当流动相的非极性最够强时（足够的有机相比例），极性化合物才 会有保留。但是，典型的疏水化合物在 HILIC柱子上却没有保留。因此 HILIC 柱可以分析一 些极性化合物的混合样，但是当样品中既有极性化合物，又有非极性化合物时，极性化合物 就会因没有保留而分不开。 图2a ：HILIC 柱典型的保留行为，亲水性和疏水性化合物在 HILIC 柱上的 保留图 一个用 HILIC 柱子分离极性化合物的例子如图 2c所示（4）。显然这两种极性化合物在普通 C18 柱上是没有保留的（Figure 2b）。如果分析对象只有极性化合物 HILIC 柱子是很合适 的选择，就像我们在图 2b 和2c 中看到的一样