实验七和八 酵母核糖核酸的分离及组分鉴定(天行健,君子以自强).ppt

实验七 核酸的定量测定—定磷法;;;二，试剂 1.标准磷试剂（含磷5μg/ml）:准确称取恒重（105℃ ）的 0.4389g,用水定容到100ml，此液的浓度为1mg/ml，用前再稀释200倍，即为5μg/ml。 2.定磷试剂： (1)6mol/L硫酸：取17ml浓硫酸（比重1.84）缓缓加入83ml水中。 (2)2.5%钼酸铵：2.5g钼酸铵溶于100ml水中 (3)10%抗坏血酸溶液：取10g抗坏血酸溶于100ml水中。棕色瓶4 ℃ 贮藏。溶液应为淡黄色，深黄色或棕色则不能用。;3. 催化剂：硫酸铜（ ）：硫酸钾 （ ）=1：4（W/W）,研成细末。 4. 30%过氧化氢，浓硫酸; 三，操作方法 1.制作磷标准曲线： 取标准磷酸溶液（ 5μg/ml ）0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0ml，用水补足到3ml，含磷量分别为0，2.5，5，7.5，10，12.5，15 μg，加定磷试剂3ml后摇匀，45 ℃放置20分钟，测 。以含磷量为横坐标， 为纵坐标制作标准曲线。 2. 核酸中总磷量的测定： 取1ml被测样品液（约含2.5—5mg核酸，也可取固体样品），置于消化瓶中，加入1ml浓硫酸及50mg催化剂，在消化炉上加热至发白烟，样品由黑变成淡黄色，取下稍冷，加数滴30%过氧化氢液，继续加热至 ;; 四，结果 首先制作标准磷曲线，以消化和未消化的样品中的 从标准曲线上查出各自对应的磷含量。 计算样品中核酸含量，按下式进行： 计算样品中核酸含量，按下式进行： 样品中核酸含量%= 其中：有机磷量(μg)=总磷量—无机磷量 D为稀释倍数,即= ;实验八 酵母核糖核酸的分离及组分鉴定;三，器材： 乳钵 2. 150毫升锥形瓶 3. 水浴 4. 量筒 5. 吸管，滴管 6. 试管及试管架 7. 烧杯，漏斗 8. 离心机;四，试剂和材料： 1. 0.04mol/L 氢氧化钠溶液 1000ml 2. 酸性乙醇溶液 500ml 3. 95%乙醇 1000ml 4. 乙醚 500ml 5. 3当量/升硫酸 200ml 6. 浓氨水 50ml 7. 0.1mol/L硝酸银溶液 50ml 8. 三氯化铁浓盐酸溶液 80ml 苔黑酚乙醇溶液 10ml 10. 酵母粉;; 五，操作方法： 将7.5g酵母悬浮于45毫升0.04mol/L氢氧化钠溶液中，并在乳钵中研磨均匀。将悬浮液转移至150ml锥形瓶中。在沸水浴上加热30分钟后，冷却。离心（3000转/分）15分钟将上清液缓缓倾入15毫升酸性乙醇溶液中。注意要一边搅拌一边缓缓倾入。待核糖核酸沉淀后，离心（3000转/分）3分钟。弃去清液。用95%乙醇洗涤沉淀2次，乙醚洗涤沉淀1次后，沉淀在空气中干燥。 将提取的核酸，加入3当量/升的硫酸5ml，在沸水浴中加热10分钟制成水解液并进行组分的鉴定。 ; 1.嘌呤碱： 取水解液1ml加入过量浓氨水，然后加入约1ml 1mol/L的硝酸银溶液，观察有无嘌呤碱的银化合物的沉淀。 2.核糖：取1支试管加入水解液1ml，三氯化铁浓盐酸溶液2毫升和苔黑酚乙醇溶液0.2毫升。放沸水浴中10分钟。注意溶液是否变成墨绿色，说明核糖的存在。 3.磷酸：取一支试管，加入水解液1ml和定磷试剂1ml。在水浴中加热，观察