HLA-DR1二聚体的构建及其在昆虫细胞中的表达和纯化.pdfVIP

第 39卷第 3期第 305页 华 中科技大学学报 (医学版) VolJ39 No．3 P．305 2010年 6月 ActaMedUnivSeiTeehnolHuazhong June． 2010 HLA—DR1二聚体的构建及其在昆虫 细胞 中的表达和纯化* 宋银宏 ， 刘 燕 ．2#， 牛 力。， 翁秀芳 ， 孙 伟 ， 于 倩 ， 吴雄文 华 中科技大学 同济 医学院基础医学院免疫学系，武汉 430030 九江学院基础医学院 病原生物学与免疫学教研室，。生理学与病理生理学教研室，九江 332000 摘要 ：目的 构建 HLA—DR1(由DRA和 DRB1*01基因编码)杆状病毒表达载体 ，并使其在昆虫细胞 内得到表达 。 方法 采用 RT—PCR方法从 721．221细胞 中扩增 DRu和 DRft的信号肽及胞外序列，运用重叠 PCR将 DRa和DR,3片段 分别与 Fos和 Jun的亮氨酸拉链序列相连 ，成为 DR—Fos和DRI3一Jun，DRa和DRI3可凭借 Fos和 Jun的亮氨酸拉链结合 形成 DR1分子 ，再通过 EcoR I酶切位点将 DRa—Fos和人 IgG1的Fc段相连 ，形成 DRa—Fos—Fc重组序列，2个 同源的 DR1分子可通过 IgG1的 Fc段 的二硫键结合形成二聚体 。分别将 DRa—Fos—Fc及 DRI3一Jun插入杆状病毒表达载体 pFastBac Dual的2个多克隆位点处 ，构建 出重组载体 pFastBac Dua1+[DR1／Fc]。对构建的载体进行 PCR及 限制 性 内切酶酶切鉴定和测序。采用脂质体转染方法将表达载体转入 昆虫细胞系 Sf9中，通过双抗夹心 ElISA及 Western blot检测 HLADR1的表达 。结果 PCR及酶切鉴定和测序证实 目的基 因插入正确且序列与 GenBank一致 。ELISA 和Westernblot检测表明DR1杆状病毒感染 的 Sf9细胞培养上清 HLA—DR1表达呈 阳性 ，且表达的 HLA—DR1分子具 有正确 的构象。结论 成功构建 出杆状病毒表达载体 pFastBac Dual+[DR1／Fe]，并在 SI9细胞 中得到表达 ，为研究 HLA-DR1限制性 的 T细胞应答奠定了基础。 关键词 ：HI，A—DR1； 二聚体 ； 杆状病毒载体 ； 昆虫细胞 ； 基 因表达 中图分类号 ：R3433 DOI：10．3870／j．issn．1672—0741．2010．03．005 Construction ofHLA—DR1Expression Vectorand ItsExpression in InsectCells SongYinhong 。LiuYan ’ ，NiuLi。etal InstituteofImmunology，SchoolofBasicMedicalSciences，TongJiMedicalCollege，Huazhong UniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China 。DepartmentofPathogenicOrganismandImmunology，DepartmentofPhysiologyandP口￡o户^s0z0g ， SchoolofBasicMedicalSciences，JiujiangUniversity，Jiujiang332000，China Abstraet Objeetive ToconstructabaculovirusexpressionvectorwhichcarriesthegeneofHLA—DR1(codedbyDRA． DRB1*O1genes)。and investigatetheexpression ofHLA—DR1dimermoleculesininsectcells．Methods Thesigna1andex— tramemb