TaqMan法进行实时定量PCR鉴定.doc

3.3 TaqMan法进行实时定量PCR鉴定 较普通PCR而言，实时定量PCR有更高的灵敏度，因此需要进一步优化反应条件。PCR反应在Applied Biosystems StepOneTM Real-Time PCR System (ABI公司仪器)sequence detector中进行。采Taqan法进行绝对定量ρ0 eLa细胞中mtDNA的拷贝数。 3.3.1 荧光定量试剂及探针 1) Premix Ex TaqTM (Perfect Real Time)，购自宝生物工程（大连）有限公司。 2) PCR 反应引物以及探针均由宝生物工程（大连）有限公司合成。 3.3.2 构建质粒标准品的目的片段的扩增及纯化 本试验对以往所报道拷贝数的文献进行了筛选，通过比较选用了常用的核基因中的β-actin基因做为的参照，Cox-I基因做为正常线粒体基因[40]，其中β-actin基因的引物为实时荧光定量的引物，Cox-I基因的引物则为本实验室扩增线粒体全序列的引物中的第九对引物[41]。引物所在位置、引物序列、目的片段的长度以及复性温度见表。引物处理、PCR试剂、反应体系等同前面扩增PCR，复性温度依据表。扩增目的片段并纯化之后与T载体连接。引物名称 引物位置 引物序列（5’→3’） 目的片段长度 复性温度 β-actin F 1997-2017 ACCCACACTGTGCCCATCTAC 107 bp 58 ℃ β-actin R 2103-2081 TCGGTGAGGATCTTCATGAGGTA Cox-I F1 5835-5855 GAGGCCTAACCCCTGTCTTT 827 bp 59 ℃ Cox-I R1 6661-6642 ATTCCGAAGCCTGGTAGGAT 表 F表示正向引物，R表示反向引物。β-actin F与β-actin R用于扩增β-actin基因的一段区域缺失区域，引物序列同荧光定量时引物序列；Cox-I 1 F与Cox-I R1用于扩增Cox-I基因的一段序列3.3.3 感受态的制备（于超净工作台无菌条件下及冰上操作）1) 取上述1 ml培养液于1.5 ml EP管。 2) 4 ℃ 4000 rpm 离心5 min，弃上清。 )加入100 μl冰中预冷的Solution A，轻轻弹动使沉淀悬浮（可轻轻吹打）。 ) 4 ℃ 4000 rpm 离心5 min，弃上清。 ) 加入100 μl 冰中预冷的Solution B, 轻轻弹动使沉淀悬浮。 ) 感受态细胞制作完成（可直接用于DNA转化实验或-80 ℃保存，以备后用）。 3.3.4 目的DNA片段的连接及感受态细胞的DNA转化 1) 在微量离心管中配制下列DNA 溶液，总量为5 μl。 pMDTM 18-T Vector 1 μl Insert DNA 0.1 pmol～0.3 pmol dH2O 补至 5 μl (2) 加入5 μl（等量）的 Solution I。 (3) 16 ℃连接过夜（8小时）提高反应效率及连接产率。 (4) 取-80 ℃保存感受态细胞冰中融化10 min。 5) 取100 μl的感受态细胞移至新的EP管中。 6) 向感受态细胞中加入（3-10 μl）的转化用DNA(连接产物)，轻轻混匀后冰中放置30 min。 7) 42 ℃水浴中放置45 s-60 s后，立即于冰中放置1-2 min。 8) 加入890 μl 37 ℃预温的SOC培养基。 9) 37 ℃振荡培养1 h（﹤200 rpm）。 10)取适量于含有 X-Gal、IPTG、Amp 的 L-琼脂平板培养基上培养，将平板倒置于37 ℃培养箱中培养过夜形成单菌落，计数白色、蓝色菌落。 11)挑选白色菌落，使用PCR法确认载体中插入片段的长度大小。确认培养菌落，进行下步实验。 12)取3 ml LB各支加3 μl氨苄，挑取菌落于其中，37℃（150-200 rpm）轻振荡过夜。 3.3.5 使用质粒提取试剂盒提取质粒 测序以及质粒浓度的测定时对质粒DNA的纯度要求较高，本试验采用宝生物公司的质粒提取试剂盒MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0进行质粒的提取。该试剂盒是用于质粒（Plasmid）DNA 小量纯化的试剂盒，采用了传统的 SDS 碱裂解法，结合DNA 制备膜技术，具有高效、快速、方便之特点，全套操作只需 1 小时便可完成。使用本试剂盒可从 1～4 ml 的过夜培养的菌液中纯化得到1～20 μg 的高纯度质粒DNA（OD2