182 培养基灭菌.ppt

第18章 培养基灭菌及灭菌设备 杂菌污染产生的不良后果 ①杂菌的污染，使生物反应的某些基质和产物消耗而损失，造成生产能力和得率下降； ②杂菌所产生的一些代谢产物，使产物的分离困难； ③污染的杂菌可能会分解产物，而使生产失败； ④污染的杂菌大量繁殖，会改变反应介质的pH等理化性质，从而使生物反应异常； ⑤当发生噬菌体污染，微生物细胞被裂解，而使生产失败。 防止杂菌污染的措施 ①使用无污染的纯粹种子； ②使用的培养基和设备须经灭菌； ③培养过程中加入的物料需经过灭菌； ④好气培养过程中使用的空气需经除菌处理； ⑤设备应严格密封，生物反应器中需维持高于环境的压力。 18.1 灭菌方法 灭菌是指采用物理或化学方法杀灭或去除物料或设备中一切有生命物质的过程。 常用的灭菌方法有以下几种： ①化学药剂灭菌； ②射线灭菌； ③干热灭菌； ④湿热灭菌； ⑤过滤除菌。 18.2 培养基灭菌 对于大量的培养基和发酵设备的灭菌，最有效、最常用的灭菌方法是蒸汽灭菌（即湿热灭菌）。 衡量热灭菌的指标很多，最常用的是“热死时间”，即在限定的温度下杀死原有微生物中一定比例所需的持续时间。 影响热灭菌的温度和时间的因素很多，包括微生物的种类、性质、浓度及培养基的性质、浓度等。 18.2.1 热灭菌的原理 微生物的生长受 温度的影响。 当微生物低于其生长温度的下限时，代谢作用几乎停止而处于休眠状态。 当温度超过微生物生长温度的上限时，微生物细胞中的蛋白质会发生不可逆的凝固变性变化，在很短时间内引起微生物的死亡。热灭菌即是利用微生物的这一特性进行的。 18.2.1 热灭菌的原理 能杀死微生物的温度称为致死温度。在致死温度以上，杀死全部微生物所需的时间称为致死时间。温度越高，致死时间越短。 一般常温微生物在60℃，10 min即可死亡。而芽孢杆菌的芽孢在100℃温度下，要经数分钟至数小时才能杀灭。有些嗜热微生物能在120℃温度下，耐受20～30 min。 一般衡量灭菌彻底与否，是以能否杀灭芽孢细菌为标准。 18.2.2 对数残留定律 营养细胞热灭菌可认为是一级反应： 积分方程为： （18－2） 18.2.2 对数残留定律 对于芽孢可看作是一级串联反应： 积分方程为： 18.2.2 对数残留定律 灭菌时间： or 其中k为死亡速度常数（比死亡速率）。 18.2.2 对数残留定律 随着温度的变化，死亡速度常数k的值变化很大（温度的影响）。温度对k 值的影响，遵循阿仑尼乌斯定律，即 培养基在灭菌前，存在着各种各样的微生物，它们的k值各不相同，可以取耐热性芽孢杆菌的k值进行计算： 18.2.2 对数残留定律 N的取值： N＝0.001=0.1% 即灭菌失败的概率为千分之一。 微生物数目降低至最初的十分之一所需时间D: 半衰期t1/2： 18.2.3 培养基灭菌温度的选择 由于培养基的破坏属于分解反应，也可看作是化学动力学中的一级反应，其反应动力学方程式为： 在化学反应中，其他条件不变，则分解速率常数K‘ 和温度的关系也可用阿仑尼乌斯方程式表示： 18.2.3 培养基灭菌温度的选择 可见随着温度的升高，k值增大，且ΔE越大，温度的影响越明显。 （18－15） 活化能 18.3培养基的分批灭菌 培养基的分批灭菌是指将配制好的培养基放在发酵罐中，通入蒸汽进行灭菌的过程，也称实罐灭菌。它是小型发酵罐常用的一种灭菌方法。 分批灭菌的过程包括升温、保温和冷却三个阶段，灭菌主要在保温过程中实现，在升温的后期和冷却的初期，培养基的温度很高，亦有一定的灭菌作用。分批灭菌的计算应包括这三个阶段。但一般只考虑保温过程的灭菌作用。 1 8.4 培养基的连续灭菌 培养基连续灭菌是将配制好的培养基在高温快速的情况下，向发酵罐输送的同时经过加温、保温、冷却的过程，进行灭菌。 连续灭菌时，培养基能在短时间内加热到保温温度，并能很快被冷却，因此，可在比分批灭菌更高的温度下灭菌，而保温时间则很短，这样就有利于减少营养物质的破坏。 18.4.1 连续灭菌的流程 连续灭菌的流程如下： 罐式连续灭菌的流程见图18-3。培养基经配料后，经配料罐放出，用泵送入加热器或连消塔底端，由顶部流出，进入维持罐，维持10 min左右，由维持罐上部流出，经喷淋冷却器冷却到发酵温度，送去发酵罐。 18.4.2 连续灭菌的设备和计算 1.预热 预热可在培养基配制罐或预热罐中进行，使培养基的温度升到70℃左右。 18.4.2 连续灭菌的设备和计算 3保温 培养基在加热器中被加热到预定的灭菌温度后，进入保温设备（维持设备）中，经过一段时间保温，使培养基中所含微生物全部杀灭。连续灭菌的保温设备有两种形式：罐式保温设备、