1支湖水初发酵.ppt

微生物与环境检测实验——多管发酵法测量水中大肠菌群 一、目的要求 1、学习测定水中大肠菌群数量的多管发酵法 2、了解大肠菌群的数量在饮水中的重要性 二、基本原理 三、实验器材 1、培养基： 乳糖蛋白胨发酵管(内有倒置小套管)， 三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管 (内有倒置小套管)， 伊红美蓝琼脂平板，灭菌水。 2、仪 器：干热灭菌锅，高压蒸汽灭菌锅，洁净工作台，培养箱，灭菌吸管，灭菌试管，培养皿，灭菌三角瓶。 四．操作步骤 1．培养基配置 (1)．乳糖蛋白胨培养液： 蛋白胨 10g 牛肉膏 3g 乳糖 5g NaCl 5g 蒸馏水 1000ml 调pH至 7.2～7.4 1.6％溴甲酚紫乙醇溶液 1ml 充分混匀，分装于有小倒管的试管中。115℃灭菌20min。 (2)．三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液 具体配置方法同上，除水以外每组分量为原来3倍。 (3)．伊红美蓝培养基：(EMB培养基) 称取伊红美蓝琼脂干粉35g，加热溶化溶解于1000ml水中，116℃灭菌30min。灭菌后，冷却至60℃左右时倒平板备用。 每升中含以下成分：蛋白胨 10g 乳糖 10g 磷酸氢二钾 2g 2% 伊红水溶液 20ml 0.65% 美蓝水溶液 10ml 琼脂 15g 2．自来水检查 (1)．水样的采取：火焰烧灼水龙头3min灭菌，放水5min后，以灭菌三角烧瓶接取水样，待分析。 (2)．初发酵试验：在2个含有50ml三倍浓缩的乳糖蛋白胨发酵烧瓶中，各加入100ml水样。在10支含有5ml三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管中，各加入10ml水样。混匀后，37℃培养24h。24h未产气的继续培养至48h。 (3)．平板分离：经24h培养后，将产酸产气及48h产酸产气的发酵管(瓶)，分别划线接种于伊红美蓝琼脂干板上。再于37℃下培养18～24h，将符合下列特征的菌落的一小部分，进行涂片。革兰氏染色，镜检。 ①．深紫黑色、有金属光泽 ②．紫黑色、不带或略带金眉光泽 ③．淡紫红色、中心颜色较深 (4)．复发酵试验：经涂片、染色、镜检，如为革兰氏阴性无芽抱杆菌，则挑取该菌落的另一部分。重新接种于普通浓度的乳糖蛋白胨发酵管中，每管可接种来自同一初发酵管的同类型菌落1～3个，37℃培养24h，结果若产酸又产气，即证实有大肠菌群存在。 证实有大肠菌群存在后，再根据初发酵试验的阳性管(瓶)数查表2.3，即得大肠菌群数。 3．池水．河水或湖水等的检查 (1)．水样的采取：取距水面10～15cm的深层水样，先将灭菌的带玻璃塞瓶瓶口向下浸入，然后翻转过来，除塞后盛满水样，再从水中取出，即得所测水样。须及时检测，否则应放入后冰箱中保存。 (2)．初发酵试验 ①．将水样稀释成10-1、10-2。 ②．分别吸取1ml 10-1、10-2的稀释水样和1ml原水样各注入装有10ml普通浓度乳糖蛋白胨发酵管中，另取10ml和100ml原水样，分别注入装有5ml和50ml三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管中。 ③．混匀，37℃培养24h，观察细菌产酸产气情况。 (3)．平板分离