CCK-8检测肿瘤坏死因子生物学活性.doc

CCK-8法检测肿瘤坏死因子α生物活性 (哈药集团生物工程有限公司，黑龙江，哈尔滨，150025) 摘要：以小鼠成纤维细胞L929作为研究对象，探讨了CCK-8法、MTT法和XTT法的检测范围。CCK-8适宜细胞数量范围为8×102—l×105个。在检测肿瘤坏死因子α（TNF-α）对小鼠成纤维细胞L929的杀伤活性的实验中，发现CCK-8法测得数据的线性相关性优于MTT法和XTT法，并且数据偏差小。实验结果表明CCK-8法是一种灵敏度高，准确性好的检测细胞活性的方法。 关键词：CCK-8；MTT；XTT；杀伤作用 Research of biological activity of tumor necrosis factor-α with CCK-8 ZhaoHaidan (Harbin Pharmaceutical Group Bioengineering Co., Ltd.，Heilongjiang，Harbin 150025) Abstract：As L929 mouse fibroblast cells to the research object，Discuss the detection range of CCK-8，MTT and XTT．The suitable number of cells of CCK-8 is 8 × 102—1× 105．In the detection of tumor necrosis factor α (TNF-α) on the mouse fibroblasts L929 cytotoxicity experiments, found that CCK-8 method to measure the linear correlation of data is superior to MTT and XTT，and the data deviation is small . The results show that CCK-8 is a high sensitivity, good accuracy method in cell activity assays. Key words：CCK一8；MTT；XTT；cytotoxicity Cell Counting Kit-8简称CCK-8试剂盒]，CCK-8检测试剂中含有WST-8，它在电子载体1-Methoxy?PMS的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲产物（Formazan）。生成的甲物的数量与活细胞的数量成正比。用测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。该方法已被广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞增殖试验、细胞毒性试验以及药敏试验等。]。因此，本实验采用CCK-8法检测肿瘤坏死因子α（TNF-α）对小鼠成纤维细胞L929的杀伤活性[3]，并与MTT法、XTT法[4]进行比较，验证其灵敏度和准确性。 1材料与方法 1.1材料 1.1.1细胞株 小鼠成纤维细胞L929 (购自中科院上海细胞库)。 1.1.2仪器和试剂 CO2培养箱(Thermo)；酶标仪(Molecular Devices)；超净工作台(上海博迅)。MTT(SIGMA)；CCK-8试剂盒(日本同仁化学)；10％SDS；RPMI 1640培养基(GIBCO)；DMSO(SIGMA)；TNF-α (Biosorce)；10％胎牛血清(PAA)。 1.2方法 1.2.1 细胞数与吸光值的关系 将处于对数生长期的L929细胞用胰酶进行消化，中和，900r /min 离心3min，用RPMI1640培养基重悬，用细胞计数板计数。将细胞密度调整到1×106个/ ml，再于96 孔细胞板中倍比稀释，每孔100ul，每个细胞浓度5 个复孔。置37℃，5% CO2 培养箱过夜培养。在制备好的96 孔细胞板中分别加入CCK-8 试剂、MTT试剂和XTT试剂，达到培养所需时间后，在酶标仪上测量OD值。 1.2.2 三种方法检测TNF-α对小鼠成纤维细胞L929的杀伤活性 用胰酶将处于对数生长期的L-929细胞进行消化，用培养基进行重悬并用细胞计数板计数。将细胞的密度调整为1 x 105 个/ml，在96孔板中加入100ul/孔。将培养板放于37℃，5% CO2培养箱中过夜孵育。用培养基将TNF-a的起始浓度调整为100ng/ml，3倍稀释，9个梯度，1个细胞空白对照。弃去已含有L929细胞的96孔板的上清液，小心的将TNF-a稀释液转移至预孵育细胞的培养板中，100 ul/孔，将培养板放于37℃，5% CO2培养箱中过夜孵育。分别加入CCK-8试剂、MTT试剂和XTT试剂，达到培养所需时间后，在酶标仪上测量