0巨型艾美耳球虫的纯化 _20101116.doc

巨型艾美耳球虫单卵囊纯化设计与记录 试验编号：EM 实 验 人: __王天成 _ ___ 实 验 时 间：10年11月 5 日～月 日 实 验 地 点离心2010/11/15 在雏鸡入舍前，先移出动物房内所有可移动设备与装置，以汽油喷灯烧烤地面，鸡笼刷干净后用汽油喷灯火焰消毒。地面、地面以上2米的墙壁及其它所有突出墙外的附属设施氨水喷雾消毒水槽、料槽min以上。 熏蒸 密闭门窗，进行熏蒸消毒（鸡舍需用福尔马林、高锰酸钾）24～48h，用前通风24～48h待用。 .2电线、塑料布、水槽、料槽的处理 80℃min以杀灭球虫卵囊。 .3鸡笼处理 塑料布包裹消过毒鸡笼，鸡笼准备养鸡。2010/11/19，选择大日龄鸡，减少母源抗体影响。 1.2.2.1琼脂块制备：取1g琼脂粉、0.75g蔗糖溶于100ml蒸馏水中，加热使其充分融解，后冷至40℃左右时均匀倾倒于载玻片上，琼脂板厚约1.5—2mm即可，置于4℃冰箱冷却后使用（不易放置时间过长，否则水分减少不易观察液滴）。用时将其切成0.4cm见方的小块，置于洁净载玻片上。 1.2.2.2 卵囊稀释 卵囊稀释：取少量卵囊液，用稀释至显微镜下观察每滴只有一到两个球虫卵囊为止。用健康鸡标准 检查项目 健康检查标准 外观 羽毛整齐，光泽均匀，触摸有柔软油滑的感觉；翅膀自然紧贴鸡体。脚爪的鳞片和皮肤有光泽。 神态 精神充沛、体态丰匀、眼睛灵活有神、声音宏亮、昂首挺立、动作敏捷、双脚暖和，呼吸不张嘴。 采食消化 食欲旺盛，经常有采食动作。腹部大小适中，雏鸡腹部应柔软，脐部愈合完全。 天然孔 鼻、眼及泄殖腔周围羽毛干净。 活力 将鸡翅膀提起，挣扎、蹬脚有力，鸣声长而响亮，有一定重量，表明鸡活力强。 粪便 粪便为软硬适中的堆状或条状物，上面覆有少量的白色沉淀物。 粪便卵囊 试验前连续7天镜检粪便，无球虫卵囊存在。（此项适用于接种前7天鸡）。按《动物球虫病诊断技术》（GB／T18647-2002）2.2.1项进行。 健康鸡粪便卵囊检查《动物球虫病诊断技术》（GB／T18647一2002）2.2.1项） （1）取被检动物或动物群的新鲜粪便l0g，放入50mL烧杯中，加入适量水。 （2）轻轻搅匀，经60目铜丝网或尼龙网过滤。 （3）将滤液移入4支10 mL～15 mL试管，2500r／min离心l0min。 （4）倾去上清液，各管沉淀物中加入少量饱和盐水，混匀。各管的沉淀物混悬液移入一个5mL玻璃瓶。 （5）用饱和盐水加满，盖上盖玻片(盖玻片须能与液面接触)，静置10min。 （6）取下盖玻片，放在载玻片上。 （7）置载玻片于显微镜台上，用l0×10或10×40的倍数进行检查。 （8）判定： a)发现球虫卵囊，判为阳性，说明该动物(群)己感染球虫。 b）未发现球虫卵囊，需重复检查5次，仍未见球虫卵囊，本粪样可判为阴性。只有连续检查粪便7d～10d，均未发现球虫卵囊，方可说明该动物(群)未感染球虫。 将琼脂板置于显微镜下，先在低倍镜下观察找到琼脂小块,然后用牙签蘸或吸管取稀释好的卵囊液滴在琼脂块上在显微镜下观察（观察时注意小液滴周围的折光,待水分缓慢蒸发,周围黑色折光圈便会慢慢消失）。观察到多个卵囊或未孢子化卵囊时,则弃之不用。确定液滴内有且只有一个孢子化卵囊且卵囊直径大于30μm时，将一小块糖衣纸覆盖于液滴上。先经口滴入1～2滴蒸馏水，然后将盖有糖衣纸的琼脂块喂给无球虫小鸡，再滴入1～2滴蒸馏水，促其吞咽，待确定吞咽后放回鸡笼。 1.2.2.5 雏鸡接种后检测 将感染单个卵囊的鸡严格隔离饲养，笼具都经过火焰消毒，饲料经过高压处理，饮水为凉开水。从感染后120h开始，每24h逐只用饱和食盐水漂浮法和涂片法镜检其粪便，观察有无球虫卵囊。具体方法为：将每只鸡的粪便用消毒后的小塑料袋取回（按1.2.2.3项检测粪便），并编号，分别置于已编号的小青霉素瓶中，用饱和食盐水进行漂浮（10min～30min）2.5%的重铬酸钾溶液中，放于27℃温箱内培养，当85%以上卵囊孢子化后，于4℃冰箱保存。 1.2.2.6单卵囊后代球虫卵囊的收集及保存 1）Ⅰ粪便：生理盐水浸10倍的生理盐水浸泡并不时地搅拌，直到粪便中的卵囊大部分溢出到水中（大约1小时）用过滤粪便，次过滤后剩余粪便用倍于粪便的生理盐水稀释并搅匀后再过滤，倍于粪便的生理盐水稀释并搅匀后再过滤 Ⅱ取小肠内容物：用剪刀将小肠纵向剪开，刮取小肠内容物置于试管中。将小肠置于盛有适量生理盐水的研钵中轻研磨、冲洗（重复三次）。并将每次的洗液倒入试管中。混匀后80目筛过滤，并加入0.5％的洗洁精。 2）洗：放到离心管里，加到离