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FAME方法分析茄子青枯病土壤的微生物多样性 朱育菁，王秋红，史 怀，苏明星，陈 璐，刘 波 （福建省农业科学院农业生物资源研究所，福建 福州 350003） 植物健康程度是土壤健康状况的一个重要反映，植物病害发生（特别是土传病害）时被认为是生态系统处于不稳定和不健康状态。长期以来用作物病情指数来估计土传病害发生程度和土壤防病能力高低，而对土壤的内在指标缺乏研究。实际上土壤微生物是生态系统结构和功能变化的敏感响应者。微生物多样性、群落结构与土传病害和土壤健康状况之间存在密切联系。因此，土壤微生物群落和种类可用于估计土壤防病和健康程度。但传统的微生物培养方法仅分析了土壤微生物总数的0.1%至10%，也无法测定微生物群落结构和功能特征。近年来发展的Biolog微平板方法、脂肪酸分析（FAME）和核酸分析法为土壤微生物研究提供了新的手段，与传统培养技术相比较，具有快速、直接、全面而准确等优点。 磷脂脂肪酸谱(PLFA profile)常被用于研究复杂群落中微生物的多样性。磷脂是所有生活细胞的细胞膜的基本组分．PLFA是磷脂的组分。具有结构多样性和高的生物学特异性，是特别有效的生物标记物，可用于了解微生物群落结构．总PLFA谱中某些特征脂肪酸分别对细菌、真菌和放线菌是特异的，且在大多数情况下PLFA的某专一类型在某一土壤微生物分类群中占优势．至今，已经积累了大量关于微生物脂类的脂肪酸组成的数据。PLFA 或酯链PLFA(ELPLFA)的总量已被用作土壤样品中微生物生物量的指示物(indicator)。FAME 法能测定出土壤微生物群落脂肪酸指纹、微生物生物量和细菌、真菌生物量和功能微生物等，这些指标能估计土壤生态系统的健康程度。 细菌性青枯病是一种由青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的毁灭性土传病害，带菌土壤是青枯病最主要的初侵染源。青枯病发生与土壤微生物群落结构关系密切。本试验采用FAME分析方法，研究发生青枯病的茄子土壤微生物脂肪酸多态性与健康土壤微生物脂肪酸多态性的不同，并通过其脂肪酸的多态性，初步分析发病土壤和健康土壤微生物多样性的差异。 全株茎叶萎蔫枯死萎蔫1.2.1 培养基、试剂与分析仪器 青枯病病原菌分离纯化培养基为TTC培养。脂肪酸细菌培养基为TSBA培养基：30g(Tryptic soy broth，TSB)15 g琼脂+1L水（TSB购于Fisher公司）。试剂有：皂化试剂，氢氧化钠45 g+甲醇150 mL+水150 mL；甲基化试剂，6 N盐酸325 mL+甲醇275 mL；萃取试剂，正已烷200 mL+甲基叔丁基乙醚200 mL；洗涤试剂，氢氧化钠10.8 g+水900mL。配制方法由MIDI公司提供）。气相色谱系统采用的是美国Agilent 6890型，包括全自动进样装置、石英毛细管柱及氢火焰离子化检测器取萎蔫新鲜病组织，用75％酒精处理2 s后取出用无菌水清洗3遍，剪碎后于无菌水浸泡min，于上划线培养，3次重复30±1℃培养箱中培养。 30±1℃，培养48 h，以获得单菌落。从菌落形态结合显微分析来判断为青枯雷尔氏菌后做进一步的脂肪酸分析。 1.2.3 茄子青枯雷尔氏菌的脂肪酸鉴定 1.2.3.1 脂肪酸的提取 细菌培养条件：TSBA平板培养基，四线划线法，培养温度28±1℃，培养时间24±2h。获菌：用接种环挑取3-5环（约40mg湿重）的菌落置入一个干净、干燥的有螺旋盖的试管中（最佳的获菌区域为第3区）。皂化：加入1.0±0.1mL皂化试剂，拧紧盖子，振荡5-10sec，放入95-100℃的沸水中5min，室温冷却，振荡5-10sec，再水浴25min，室温冷却。甲基化：开盖加入2.0±0.1mL甲基化试剂，拧紧盖子，振荡5-10sec，80±1℃水浴10min，移开且快速用流动自来水冷却至室温。萃取：加入1.25±0.1mL的萃取试剂，拧紧盖子，温和混合旋转10min，打开管盖，利用干净的移液管取出每个样本的下层水相部份。基本洗涤：加入3.0±0.2mL洗涤试剂，拧紧盖子，温和混合旋转5min，打开管盖，利用干净的移液管移出约2/3体积的上层有机相到干净的气相色谱检体小瓶，用于气相检测。 1.2.3.2 脂肪酸的检测与鉴定 在下述色谱条件下平行分析脂肪酸甲酯混合物标样和待检样本：二阶程序升高柱温，170℃起始，5℃min升至260℃ ，而后40℃min升温至310℃ ，维持90S；汽化室温度250℃、检测器温度300℃；载气为氢气(2mLmin)、尾吹气为氮气(30mLmin)；柱前压l0.00 psi(1si=6.895kPa)；进样量lμl，进样分流比100:l。分析软件应用美国MIDI公司开发的基于细菌细胞脂肪酸成分鉴定细菌的软件MIS4.5（Mi