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比较所谓实时荧光定量就是实时监测过程中每一个循环的产物的荧光信号得到一个荧光变化曲线以此来实现对初始模板的定量分析对于这个定义大家可能会问两个问题第一个就是在过程中这个荧光信号是怎样产生的第二个就是得到荧光曲线后如何实现对初始模板的定量关于第一个问题我留在后面讲但大家要记住一点这个荧光信号与产物量是成正比的我先解释第二个问题统计分析方法绝对定量此方法是用一系列已知浓度的标准品制作标准曲线在相同的条件下目的基因测得的荧光信号量同标准曲线进行比较从而得到目的基因的量该标准品可以是纯化的质粒体外转录的
ABI比较 Bio-rad test * Bio-rad melting curve * MSN:grasepp@ QQ:* * * * 所谓实时荧光定量PCR,就是实时监测PCR过程中每一个循环的产物的荧光信号,得到一个荧光变化曲线,以此来实现对初始模板的定量分析。对于这个定义,大家可能会问两个问题,第一个就是在PCR过程中这个荧光信号是怎样产生的;第二个就是得到荧光曲线后如何实现对初始模板的定量。关于第一个问题,我留在后面讲,但大家要记住一点,这个荧光信号与产物量是成正比的。 我先解释第二个问题。 * 统计分析方法 绝对定量: 此方法是用一系列已知浓度的标准品制作标准曲线,在相同的条件下目的基因测得的荧光信号量同标准曲线进行比较,从而得到目的基因的量。该标准品可以是纯化的质粒DNA,体外转录的RNA,或者是体外合成的ssDNA。 ? 相对定量: 通过与内参基因Ct值之间的相差来计算基因表达差异,一般是 2-??Ct 。或者是考虑扩增效率的Pfaffl法。 绝对定量 相对定量 Marisa L. Wong and Juan F. Medrano: BioTechniques July 2005 相对定量 实时检测(在对数扩增时期)而不是终点检测 敏感性高 需要样品少 特异性高(Taqman) 精确定量 Real-time qRT-PCR优点 RT-PCR原理 Real-time qPCR原理及应用 Real-time qPCR成功关键 Real-time qPCR数据分析 Real-time qPCR常见问题及解决方案 特异性 重复性 灵敏度 其他问题 常见问题讨论 扩增的特异性 引物? Tm,重新设计引物,优化条件 Tm 重复性判断实验优劣的重要指标 判断指标:主要为标准差(SD)和变异系数(CV) 影响重复性的因素: PCR 反应扩增的效率:优化实验条件,使反应体系达到最佳扩增效率 。 目的基因的初始浓度: 使用初始浓度具有较高数量级的样本或作平行孔。 标准曲线的影响:不少于5个稀释度的标准品,涵盖待测样本中目的基因量可能出现的全部浓度范围;理想的标准品应与样本具有高同源性,质粒DNA 或是体外合成、转录的RNA。 影响灵敏度的因素 反应体系中形成的引物二聚体的影响 可以用水解探针代替SYBR Green I,有文献报导使用水解探针的敏感性要比SYBR Green I高出10倍。 可以使用热启动办法或使用特殊处理的Taq酶 要尽可能地优化引物设计 如果反应体系中出现PCR的抑制因素,应适当将目的基因的浓度稀释后再进行扩增。 注意避免室温混合各种试剂,并且在一经混合后立即开始进行扩增。 循环数 Mg2+的浓度 Q1:无Ct值(信号)出现 可能性不大 检测荧光信号的步骤有误: 一般SG法采用72℃延伸时采集,Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。 引物或探针降解: 可通过PAGE电泳检测其完整性。 模板量不足: 对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。 模板降解: 避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。 Q2:Ct值出现过晚(Ct>38) 扩增效率低: 反应条件不够优化。设计更好的引物或探针;改用三步法进行反应;适当降低退火温度;增加镁离子浓度等。 PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。 PCR产物太长: 一般采用80-150bp的产物长度。 Q3:标准曲线的线性关系不佳 加样存在误差: 使得标准品不呈梯度。 标准品出现降解: 应避免标准品反复冻融,或重新制备并稀释标准品。 引物或探针不佳: 重新设计更好的引物和探针 模板中存在抑制物,或模板浓度过高。 Q4:阴性对照也出现明显的起飞 反应mix或水被污染。 引物二聚体的出现: 用SG法在35cycles以后阴性出现起飞属正常情况,可配合熔解曲线进行分析。 反应过程中探针的降解:用PAGE电泳对探针进行检测。 ROX校正的问题:如果使用了,则可能是ROX的降解所造成。 Q5:熔解曲线不止一个主峰 引物设计不够优化:应避免引物二聚体和发夹结构的出现。 引物浓度不佳:适当降低引物的浓度,并注意上下游引物的浓度配比。 镁离子浓度过高:适当降低镁离子浓度,或选择更合适的mix试剂盒。 模板有基因组的污染:RNA提取过程中避免基因组DNA的引入,或通过引物设计避免非特异扩增。 Q6:扩增效率低 反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。 反应条件不够优化:可适当降低退火温度或改为三步扩增法。 反应体系中有PCR反应抑制物:一般是加入模板时所引入,应先把模板适度稀释,再加入反应体系中,减少抑制物的影响。 Q7:同样的试剂在不同仪器上产生不同的曲 线,如何比较? 判断标准:扩增
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