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基因工程Gene Engineering 第3章 基因工程工具酶 Tool Enzymes in Gene Engineering 基因工程的四大要素 工具酶 tool enzymes 目的基因 interested gene 载体 vector 受体细胞 receipt cells 基因工程实验中常用的工具酶 3.1 限制性内切酶 3.1.1 细菌的限制-修饰系统（ R-M系统） 3.1.3 限制性内切酶分类 限制修饰系统的种类 （a）I型：由三个基因构成，hsd R；hsd M；hsd S（host specificity for DNA restriction modification and specificity）位于染色体上，三个基因产物构成一个复合体，限制酶需要ATP、Mg2+、SAM（５—腺苷甲硫氨酸）。 （b）II型：限制与修饰基因产物独立起作用。 （c）III型：修饰酶与Ｉ型酶相同，hsdＭ与hsdＳ基因产物结合成一亚单位，限制酶是独立存在的。 上述三个系统中，只有II型限制酶与甲基化酶具有相当高的核苷酸识别特异性，因而被广泛用于基因工程中。 核酸限制性内切酶的类型及主要特性 I型限制性内切核酸酶有其特定的DNA识别序列，但酶在DNA上的切割位置远离其识别位置，有的酶可在同识别序列相距1 000 bp的位置上随机切割。 l型限制酶对体外重组DNA实验没有多少用处。 III型限制性内切核酸酶在DNA上有其特定的识别序列，其酶切位置在识别序列3‘端之外相距约20个碱基对处，可以产生各种类型的单链末端。Ⅲ型酶有其特定的用途。 II限制性内切核酸酶在DNA上有其特定的识别序列即，回文结构，通常为4-8bp，在特定识别位点处切割DNA。是基因工程中主要使用的酶类。 （1）同裂酶（Isoschizomers) ② 不完全同裂酶： （2）同尾酶(Isocaudamers） 同裂酶 （ Isoschizomers ） 同尾酶 （ Isocaudamers ） 3.1.7 限制性内切酶识别序列出现的几率及酶切片段的估算 3.1.8 影响限制性内切酶活性的因素 2. DNA的甲基化程度 3. DNA的分子结构 4. 缓冲液(Buffer) 5. 酶切消化反应的时间和温度 6. 反应体积和甘油浓度 7. 星号（*）活性 3.1.9 限制酶酶切反应的终止 3.2 DNA 连接酶（Ligase） 3.2.1 作用机制及特点 2. 连接条件 3. 连接反应的温度 4. 影响连接反应的因素 3.3 DNA聚合酶（ Polymerase） 常用的DNA聚合酶的特点 3. 常用DNA聚合酶的特性比较 （2）DNA聚合酶I（Pol I）的反应条件 （3）用DNA聚合酶I 制备探针 ② 探针的标记方式 ③ DNA聚合酶I 对探针序列的标记 3.3.2. Klenow fragment （2）主要用途 ③ cDNA第二链的合成 3.3.3. T4 DNA聚合酶 ③ 特点 （2） T4 DNA聚合酶的用途 3.3.4. T7 DNA聚合酶 （2）T7 DNA聚合酶的特点 （3）T7 DNA聚合酶的用途 修饰后的T7 DNA聚合酶 3.3.5. 反转录酶 （3）逆转录酶的用途 2. 碱性磷酸酶的特性 2、双链DNA外切酶 2. ?核酸外切酶（? exo） 3. T7基因6核酸外切酶 3. S1核酸内切酶的功能 4. S1核酸酶的用途 （2）用mRNA测定基因中的外显子序列 Bal 31核酸酶 4. Bal31的用途 Bal31控制消化法： （a）特点：具内切酶活性，作用于ds -DNA，但无核苷酸序列特异型，产生5’-P低聚核苷酸; Ca2+ , Mg 2+ 或Ca2+ , Mn2+可使酶活达最大值 当酶浓度很低时，ds -DNA分子上将形成切口，不同类型二价阳离子对两条链上切口位置形成有以下影响：Mg 2+存在时，两条链上的切口独立无关Mn2+存在时，两条链上的切口几乎在同一位置 （b）用途 切口平移（nick translation)，制备DNA探针 制备RNA样品时除去DNA分子 基因突变时产生切口 大部分用于RNA的核苷酸序列分析或除去DNA样 品或蛋白质合成系统中的RNA分子。RNase的识别 （a）RNase A 分离自牛胰脏，对热稳定，抗去污剂（100℃加热15min仍具活性）, 用于除去DNA样品中的RNA分子。 （b）RNase H 作用于DNA-RNA杂交分子中的RNA链，用于cDNA文库建立时除去DNA链以便第二条链cDNA链的合成。 3.4.