rnai在植物中应用的方法.ppt

4. RNAi的效果分析 可从mRNA和蛋白质两方面进行。 mRNA：RT-PCR；定量PCR；Northern 杂交等。 蛋白质：Western杂交；ELISA；免疫荧光等。 细胞的代谢过程，生理生化系数等表型参数的变化是RNAi效果最终和最大的体现。 5、RNAi在植物中应用的方法 （1）瞬时性的RNA沉默 导致产生瞬时性RNA沉默的方法包括 基因枪轰击法 病毒侵染法 基因枪法 基因枪轰击法尽管也能产生持久性的转基因效应，但在RNA沉默中它更多的应用于瞬时性的RNA沉默研究。用该方法对植物的转化速度快，并且当DNA进入目标组织后就会被释放并迅速表达dsRNA而产生RNA沉默现象 Schweizer等通过基因枪轰击谷物如小麦、玉米和大麦的叶片表皮细胞将表达dsRNA或hpRNA的DNA结构转化入植物并引发RNA沉默，这种方法已经在沉默内源基因A1、MLO、GUS基因中得到证实,表现为目标基因活性的降低 。 Klahre等在转GUS基因烟草中通过基因枪介导的dsRNA、siRNA和正义、反义RNA轰击以使GUS抑制蛋白沉默，发现每种方法都能产生siRNA而导致GUS抑制蛋白的沉默,结果使GUS能正常表达。 病毒诱导的基因沉默 病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing,VIGS)是通过改造侵染植物的病毒使其携带用于产生RNA沉默的DNA序列，当用该病毒侵染植物时则产生RNA沉默现象 Kumagal等将人工构建的植物基因PDS的片段插入烟草花叶病毒基因组中使其产生包含正向或反向PDS序列片段的RNA时产生了光褪色现象,揭示内源的PDS基因被沉默 （2）持久性的RNA沉默 目前,在植物中持久表达RNA沉默通常采用构建表达载体,通过PEG介导、电穿孔介导、农杆菌侵染等方法使设计的序列整合到植物基因组中并稳定表达 Stoutjesdijk等报道拟南芥中到T5代时RNA沉默仍然是遗传稳定性的 。 Wesley等系统研究了不同结构的RNA对沉默效率的影响，发现相比于单链正义或反义RNA，双链RNA尤其是发夹式结构的RNA(hpRNA)对RNA沉默的效率有非常显著的提高。如果在发夹结构的反向重复序列间加入一段非编码序列如内含子，在植物体内转录形成含内含子的发卡结构(intronsplicinghpRNA，ihpRNA),则沉默效果与hpRNA相比可从58%提高到90% 6、RNAi在植物中的应用领域 RNAi在植物功能基因组研究中的应用 RNAi为大规模高效及复杂的功能基因组学研究提供了一个便捷的平台 。 Chuang等在花发育研究中采用RNA沉默技术验证了AG、CLV3、APl、PAN等已知功能基因,并开创了RNA沉默技术在植物功能基因组学中的应用 。 Miki等利用水稻OsRac基因家族保守性序列设计RNA沉默载体，成功的对OsRac基因家族进行了沉默，发现该突变株系生长状况和植株高度均比正常的要差，揭示该基因家族在生长发育过程中有重要的作用 RNAi在作物品质改良中的应用 尽管产量问题在传统育种和植物遗传工程研究中是最重要的目标,改善植物营养价值方面也越来越受到重视。常规育种方法在改善食物营养方面取得了卓有成效的成功，然而操作耗时，并且对于作物性状的改良只限于已经得到的突变体材料 而利用RNA沉默技术，其优越性不仅表现在可操作基因的范围和突变的种类扩大了，而且对目的基因的表达有了可控性 Liu等利用RNA沉默技术进行了棉籽油成份的改良研究,通过抑制2个脂肪酸去饱和酶关键基因Δ92去饱和酶编码基因ghFAD21和ω62去饱和酶编码基因ghFAD221的表达，分别将硬脂酸含量从非转基因的2%~3%提高到40%，油酸含量从15%提高到77%，并表明通过上述后代的杂交可获得同时提高硬脂酸和油酸的植株，而且基因沉默程度没有降低 。 Ogita等利用RNA沉默技术抑制咖啡植物中编码可可碱合成酶(CaMXMT1)基因的表达,转基因植物中可可碱含量下降了30%~80%，咖啡因含量下降50%~70%，这将使咖啡因对敏感人群的刺激降低，使引发心悸、高血压、失眠等症状减少 。 利用RNA沉默产生抗病毒植物 将病毒的某一序列设计成双链结构导入植物体使之表达,可诱发RNA沉默强化植物体内天然的RNA沉默抗病毒能力，这使得高抗病毒性的转基因植物的获得成为可能 。 Waterhouse等利用马铃薯Y病毒(PVY)蛋白酶基因片段构建IRS载体进行烟草转化，获得抗性植株。 Wang等利用含有大麦黄矮病毒(Barley yellow dwarf virus，BYDV)PAV株系的复制酶基因片断构建成可产生发夹式RNA结构的载体，并将该载体导入大麦得到强抗性植株并得到稳定遗传