分子生物学基础试验.ppt

(二) 从菌落中快速提取制备质粒DNA 1. 取1.4mL菌液置于1.5mL Ep管中，转速10000r/min，离心3min。 2. 弃上清，加入150μL GET缓冲液，充分混匀，在室温下放置10min。 3. 加入200μL新配制的0.2mol/L NaOH(内含1％ SDS)，加盖，颠倒2～3次，使之混匀，冰上放置4min，最多不能超过5min。 4 加入150μL冰冷的乙酸钾溶液。加盖后，颠倒数次使之混匀，冰上放置15min。 5. 4℃，10000r/min，离心5min，上清液吸至另一干净的1.5mL Ep离心管中，如上清液浑浊则需重新离心一次。 6. 于上清液中加等体积酚/氯仿液，振荡混匀，4℃，12000r离心2min，小心吸取上清液，转移至另一1.5mL Ep管中，注意勿将两液相中间的白色蛋白薄层吸出。 7. 向上清液加入2倍体积无水乙醇，混匀，室温放置３min。用离心机于10000rpm离心5min。 8. 小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。 9. 用0.5mL 70％乙醇洗涤沉淀一次，除尽乙醇，室温自然干燥，备用。 10. 用25uL含无DNA酶的胰RNA酶(20 ug／mL)的TE重新溶解DNA，贮存于-20℃备用，可长期保存。 五、注意事项 1．收集菌体提质粒前，培养基要去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮。 2．在添加溶液Ⅱ与溶液Ⅲ后溶液的混合一定要柔和，采用上下颠倒的方法，千万不能在旋转器上剧烈振荡。其中加入溶液Ⅱ后，溶液变成澄清，并有黏性；加入溶液Ⅲ后，出现絮状沉淀。 3．苯酚具有腐蚀性，能造成皮肤的严重烧伤及衣物损坏，使用时应注意。如不小心皮肤上碰到苯酚则应用碱性溶液、肥皂及大量的清水冲洗。 4．苯酚可以用于抽提纯化DNA，由于苯酚的氧化产物可以使核酸链发生断裂。所使用的苯酚在使用前必须经过重蒸，且都必须用0.1mol/LTris-HCl (pH7.6)进行平衡。所以取酚/氯仿/异戊醇时应取下层溶液，因为上层是Tris-HCl液隔绝空气层。 5．酚/氯仿/异戊醇抽提时，应充分混匀。经酚/氯仿/异戊醇抽提后，吸取上清液时注意不要把中间的白色层吸入，其中含有蛋白质等杂质。 6．有些质粒本身可能在某些菌种中稳定存在，但经过多次移接有可能造成质粒丢失。因此不要频繁转接，每次接种时应挑单菌落。 六、问题和思考 1．裂解细菌时需注意的事项有哪些？ 2．质粒的基本性质有哪些？ 3．碱裂解法提取质粒DNA中溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的作用是什么？ 4．抽提质粒DNA的方法包括哪几个步骤？ 5．如何提高质粒DNA的产量？ 七、实验报告 1.原理：简明扼要地概括 2.材料与方法 ：包括实验材料、试剂以及用具(厂家)。不要照抄，但要写得明白，自己或他人日后能够重复。 3.结果：实验记录及数据处理 4.讨论：分析---数据；解析---现象、问题，定性地针对实验下结论。 (1)结果的准确性 (2)误差（人为、仪器） (3)问题的提出 (4)异常结果分析 (5)对实验设计的认识、体会和建议，提出改进的意见。 最后：附上个人实验结果与总结 八、实验考核 到课率及实验操作（实验仪器的维护） 50分 实验的结果 15分 实验报告 20分 公共实验的参与 10分 实验结束后的口试 5分 分子生物学基础实验 指导老师：肖靓 分子生物学基础实验 分子生物学实验技术已成为生物化学及分子生物学以及相关学科院系教学科研不可缺少的一部分。为提高学生在分子生物学技术方面的动手能力，分子生物学实验室主要开设常用而基本的分子生物学实验技术。它的内容包括质粒DNA的制备；DNA的重组；PCR基因扩增等等。 实验要求 上课时间与纪律：严格遵守老师的安排。 实验室内禁止饮食、勿高声谈话、随意走动。 课前预习、课中认真操作、课后的实验报告。 妥善保管好每组的实验器具。 实验操作要求人人动手。 值日制度：每天五位同学。 一、? 质粒DNA小量制备的实验原理 要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体（vector）。载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。 作为基因工程的载体必