利用基因工程生产的药物主要是医用活性蛋白和多肽①免疫性蛋白如.ppt

五、动物细胞中的基因表达 动物细胞表达的特点：产物可分泌到细胞外，培养液成分可人工调控，产物纯化比较容易，产物是糖基化的，接近或类似于天然产物；但动物细胞生长慢，单位体积生产率低，培养条件苛刻，费用高，培养液浓度较小 第五节 基因工程菌的稳定性 基因工程菌在传代过程中经常出现质粒不稳定的现象，有分裂不稳定和结构不稳定。不管是哪一种不稳定，都将使不含目的基因的细胞成为优势菌，从而减少基因表达的产物 ①分裂不稳定：是指工程菌分裂增殖时出现一定比例不含质粒的子代菌的现象 ②质粒结构不稳定：是指外源基因从质粒上丢失或突变，或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变 一、引起质粒不稳定的原因 在基因工程菌培养过程中，质粒的不稳定通常表现为分裂不稳定，主要与两个因素有关①含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率；②这两种菌的比生长速率差异的大小 1.对于含低拷贝质粒的工程菌，若工程菌的比生长速率较快，则容易产生不含质粒的子代菌（此时可通过降低工程菌的生长速率或增加工程菌中的质粒拷贝数能提高质粒的稳定性） 2.含高拷贝质粒的工程菌产生不含质粒子代菌的频率较低，但是大量外源质 粒的存在使含质粒菌的生长速率明显低于不含质粒菌，而不含质粒菌一旦产生，能较快地取代含质粒菌而成为优势菌（因而对这类工程菌而言，进一步提高质粒拷贝数反而会增加含质粒菌的生长负势，对质粒的稳定性不利） 将工程菌培养液样品适当稀释，均匀涂布于不含抗性标记抗生素的平板培养基上，培养10-12小时，然后随机挑出100个菌落接种到含抗性标记抗生素的平板上，培养10-12小时，统计长出的菌落数，每一样品应取3次重复的结果，计算出比值，该比值反映了质粒的稳定性 质粒稳定性的分析方法 二、提高质粒稳定性的方法 1.两阶段培养法：第一阶段先使菌体生长至一定密度，第二阶段诱导外源基因的表达 2.选择性压力（如抗生素等）：通过向培养基中加入“压力”，抑制质粒丢失菌的生长 3.间歇供氧法 4.改变稀释速率法 利用重组菌对发酵环境改变的反应较质粒丢失菌迟钝的性质，通过改变培养条件（如调控温度、pH、培养基组分、溶解氧，通过间歇供氧和改变稀释速率），抑制质粒丢失菌的生长，使工程菌生长速率具有优势 第六节 基因工程菌生长代谢的特点 菌体生长是菌体各成分尤其是生物大分子——核酸和蛋白质的综合表现，通常用比生长速率来表示。工程菌培养可通过选用不同的碳源、控制补料或稀释速率等方法来控制菌体的生长。控制菌体生长对提高质粒的稳定性、减少代谢副产物的积累、提高外源蛋白产率都有重要意义 对菌体生长的调控主要有两种观点 ①能量的供应决定了菌体的最大比生长速率 ②小分子前体和催化组分（RNA聚合酶、核糖体）的限制决定了菌体的最大比生长速率 这两种观点分别从能量和合成反应的前体这两个不同的角度研究菌体的生长 一、菌体生长与能量的关系 （一）菌体生长与能量供应的关系 菌体生长是由呼吸控制的，各种碳源通过有限的呼吸能力所提供的最大能量决定了菌体在这种培养基中的最大比生长速率 当菌体生长所需能量超过菌体有氧代谢所能提供的能量时，菌体往往会产生代谢副产物乙酸 （二）如何实现工程菌的高密度培养和提高重组产物的表达水平 ①分批培养中选用不同的碳源 ②补料培养中控制补料速度 ③连续培养中控制稀释速率 ④向培养基中补加甲硫氨酸和酵母提取物 ⑤适当提高培养基的pH值，可减少乙酸的抑制作用 这些培养方法的实质是控制菌体的糖酵解速度，使之低于三羧酸循环和呼吸链的最大代谢能力，从而避免乙酰CoA的积累和乙酸的产生 二、菌体生长与前体供应的关系 （一）菌体生长与前体供应的关系 菌体中小分子前体和催化结构（如 氨基酰-tRNA）是有限的，因而生物大分子的合成处于亚饱和状态，限制了菌体的比生长速率 在基础培养基中加入氨基酸能使菌体比生长速率提高，使蛋白质合成增加，对工程菌而言，由于质粒的复制和外源基因的转录和翻译需要与宿主细胞竞争共同的前体和催化结构，从而进一步加剧了这些成分的不足。因此，在同等培养基条件下，工程菌的比生长速率低于其宿主细胞（特别是工程菌诱导后表现更明显） （二）工程菌所含质粒拷贝数与前体供应的关系 ①在含中等拷贝质粒（50~60拷贝）的工程菌中，一些与前体物合成有关的酶的相对水平增高 ②在含高拷贝质粒的工程菌中（200拷贝以上），前体物、核糖体、一些与翻译有关的酶及延长因子等产生“严紧反应” 严紧反应：在高拷贝质粒工程菌中，由于质粒复制和外源基因的转录、翻译消耗了大量前体物和催化结构，造成蛋白质合成过程中，因前体物和氨基酰-tRNA的不足使核糖体在密码子上停留，并合成“魔点”ppGpp现象