细胞培养技术-临床医学研究中心.ppt

谢谢 5）取出0.9 ml 解冻细胞悬浮液，缓缓加入有培养基的培养容器内(稀释比例为 1:10～1:15)，混合均匀，放入CO2 培养箱培养。另取0.1 ml 解冻细胞悬浮液作存活测试。 6）解冻后是否立即去除冷冻保护剂(例如DMSO 或甘油)，依细胞种类而异，一般而言，大都不需要立即去除冷冻保护剂。若要立即去除，则将解冻之细胞悬浮液加入含有5-10 ml 培养基的离心管内，离心1,000 rpm, 5 分钟，移去上清液，加入新鲜培养基，混合均匀，放入CO2 培养箱培养。 7）若不需立即去除冷冻保存剂，则在解冻培养后隔日更换培养基。 ?四、细胞传代培养 1. 细胞生长至高密度时，即须分殖至新的培养瓶中，一般稀释比例为1:3 至1:6，依细胞种类而异。 2. 材料用品：  PBS,0.25%胰酶, 新鲜培养基  3. 步骤： 3.1. 贴壁型细胞 1） 吸掉旧培养液。 2） 用PBS 洗涤细胞一至二次。 3） 0.25%胰酶37℃ 作用数分钟，于倒置显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆粒状时，吸掉胰酶溶液。4） 轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落，加入适量的新鲜培养基，以吸管上下吸放数次以打散细胞团块，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常培养条件培养。 3.2. 悬浮型细胞(suspension cell) 1） 吸出细胞培养液，放入离心管中，离心1000 rpm 5 分钟。 2） 吸掉上清液，加入适量之新鲜培养基，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常培养条件培养。  五 细胞冷冻保存 1. 冷冻保护剂浓度为5 或10 ％ DMSO， 冷冻方法：  传统方法: 4℃30分钟---20℃60分钟---80℃ 16-18小时(或隔夜)-- 液氮槽蒸汽相中长期储存。  2. 材料用品 1） 生长良好的培养细胞  2） 新鲜培养基  3） DMSO (Sigma D-2650)  4） 无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020)   3. 操作步骤： 1）冷冻前一日前更换培养基，观察细胞生长。 2）配制冷冻保存溶液(使用前配制)：将DMSO 加入新鲜培养基中，最后浓度为5-10％，混合均匀，置于室温下待用。 3）依细胞继代培养之操作，收集培养之细胞，取少量细胞悬浮液(约0.1 ml) 计数细胞浓度及冻前存活率。 4）离心，去除上清液，加入适量冷冻保存溶液，使细胞浓度为1-5 x 106 cells/ml，混 合均匀，分装于已标示完全冷冻保存管中，1 ml/小瓶，并取少量细胞悬浮液作污染检测。 5） 冷冻保存方法: 冷冻管置于4℃30分钟→-60℃30分钟→-80℃16～18小时(或隔夜)→液氮槽蒸汽相长期储存。  细胞的冻存: 1) 选取对数增长期细胞，在收集细胞前24小时换液一次。 2) 按常规方法把培养细胞消化下来,制备成细胞悬液,计数,使总数达5×106/mL左右,离心（1000g,5min）,去上清。 3) 用等量冻存液（含20％小牛血清，10％DMSO的DMEM培养液），用吸管轻轻吹打成细胞悬液。 4) 分装入冻存管中，拧紧，用封口膜封严；分别于冻存管管壁和管盖编号。 5) 将冻存管放入冻存袋中，并在冻存记录本上注明位置，细胞名称，冻存日期； 6) 将冻存袋装入液氮罐中，以1℃/min的速度，在30?40min之内下降到液氮表面，再经30min后，投入液氮中。或者先放在?20℃冰箱放置2h，然后转入?80℃冰箱，可以?80℃冰箱一直冻存或者1?14天后转入液氮冻存。 细胞培养技术何惠娟 细胞培养技术 第一节 细胞培养基本知识 第二节 细胞培养的基本技术 第一节 细胞培养基本知识 一、前言 二、培养细胞的特性 三、培养细胞的生长过程 四、培养细胞生长的条件 一. 前言 1. 细胞培养概念 2. 细胞培养的主要优点 3. 细胞培养的研究方面 4. 细胞培养的应用领域 1. 细胞培养(cell culture)概念 从生物体内取出细胞或组织，在体外模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下进行孵育培养，使之生存和生长并维持其结构和功能的技术。 体内、外细胞的差异 体内细胞： 机体神经体液调节 和其他类型细胞影响 基因表达受到外来信号调节 增殖过程中不断发生着分化 （由一般到特殊） 高度特化的结构和功能 体外细胞： 失去机体神经体液调节和 其他类型细胞影响 细胞的许多外来信号被切断 特定分化基因表达减弱或停止 而进化中保守的增殖活动维持 （由特殊到一般） 与体内细胞结构和功能的差异 特征：失去原有形态，分化特性减弱 形态和功能趋于单一 一定