专题二胚胎干细胞的获取与生物特性.ppt

专题二： 胚胎干细胞的获取 与生物特性 一、胚胎干细胞研究历程 二、关于胚胎干细胞系的说明 四 、胚胎干细胞的分离培养方法和关键技术环节 五、胚胎干细胞的生物学特性与鉴定 * 1、Stevens（1958） 胚胎瘤细胞 （EC细胞） 2、Evans等（1981）、Martin（1981） 小鼠ES细胞系 3、1992，Matsui等（1992）和Resnick等（1992） EG细胞系系 4、Thomson等（1998）和Shamblott （1998） 人类ES细胞系和EG细胞 5、ES细胞定向分化为心肌细胞、血细胞、神经细胞、胰岛细胞、生殖细胞 等重要功能性细胞（1999-2004）。 6、体细胞克隆胚胎源的人类ES细胞系的建立（Hwang 等,2004）——因为造假 而否定。 细胞系的概念（Cell Line) 取自动物或人体并置于体外培养中生长的细胞在其传代前称为原代培养或原代细胞。当细胞持续生长增殖一段时间，达到一定的密度后，就应当将细胞分离转至新的培养皿并补充新的培养液，这称为传代。传代生长以后就称为细胞系。细胞系可分为有限细胞系和无限细胞系。有限细胞系的寿命只能维持一定的时间期限，最后，细胞增殖缓慢，进而发生衰退、死亡。无限细胞系是获得不死性而具有持久或无限增殖能力的一种细胞系。无限细胞系的建立与细胞的种族、来源及性质有关。 ES细胞系 (Embryonic Stem Cell Line) 真正意义上的ES细胞系是： 要能形成具有种系传递能力的生殖系嵌合体。目前，只有小鼠才可以称作是建立真正意义上的ES细胞系。 在人上 ，由于伦理问题不可能来制作嵌合体，因此，只能称作一般意义上的ES细胞系。 一般意义上的ES细胞系应具备以下标准： ① 能稳定传代，并且有大量未分化的细胞。 ② ES细胞检测方法检测具有多能性。 ③ 能反复冷冻、解冻而不失多能性。 ④ ES细胞遗传背景明了，来源清楚。 ⑤ 无细菌、病毒、支原体及其它病原体污染。 三、胚胎干细胞来源 1．体内体外发育的早期胚胎 　 它是建立ES细胞系的主要途径，绝大多数的ES细胞系都是通过该途径建立的。 通常取3.5-4日龄囊胚（Blastocyst），通过全胚培养、免疫外科或机械分离等方法，或两种、三种方法结合分离内细胞团(Inner cell mass ICM)，反复传代从而建立ES细胞系。Evans等（1981）、Kaufman等（1983）报道利用延迟着床囊胚建立mES细胞系。 桑椹胚、8-细胞胚胎 等早期胚胎。 通过体细胞核移植建立ES细胞系 1996年克隆羊“多利”的诞生，证明终末分化的体细胞核具有发育上的全能性，通过核移植途径建立ES细胞系是一条现实可行的途径。 Munsie等（2000）、Kawase等（2000）、 Hochedlinger等（2002）分别以小鼠颗粒细胞、胎儿神经细胞、外周血淋巴细胞作为供核细胞，成功地建立了核移植mES细胞系。但目前建系成功率较低，一般不超过5%。Hwang 等（2004）报道建立了核移植的人类ES细胞系。 异种核移植是建立ES细胞系的另一途径。 陈颖等（2003）将人成纤维细胞注入成熟的兔去核卵母细胞，建立了核移植人类ES细胞系。 3、 利用孤雌胚胎建立ES细胞 分离孤雌囊胚ICM可建立ES细胞系。Robertson等（1983）、Lin等（2003）利用孤雌胚胎建立ES细胞系不用毁坏受精胚胎，可避免毁坏受精胚胎所带来的伦理学上争议，目前已建立了孤雌胚源非人灵长类猴子的ES细胞系 。 4、自原始生殖细胞克隆转化而来的胚胎干细胞　 从受精后8.5-12.5日龄小鼠胚胎背、肠系膜和/或生殖嵴分离PGCs，结果显示PGCs在集落形态、生长特性、细胞表面标志、分化潜能与ES细胞类似，具有形成功能性配子和实现种系嵌合的能力，为与附植前胚胎来源的ES细胞相区别，现称其为胚胎生殖细胞（Embryonic germ cells EGC）， Matsui Y等（1992）首次报道建立PGCs来源的小鼠多潜能干细胞系，国内许新等 （1999）报道建立PGCs来源的小鼠多潜能干细胞系。 5 其他来源 羊水细胞、上胚层细胞、性腺………？ 1. 早期胚胎的获取处理 目前，小鼠多取3.5d囊胚，猪取9-10d囊胚；兔取3.5-4d囊胚，绵羊取8-9d囊胚，牛取6-7d桑椹胚或7-8d囊胚，人取5-8d囊胚。为了提高ES细胞分离克隆的效