05.重组技术概述幻灯片.ppt

* * M13噬菌体基因组的90%以上都编码蛋白质，pII, pV, pX的基因产物用于病毒DNA的复制。pIII, pVI, pVII, pVIII, pIX编码跨膜蛋白，构成衣壳。pI, pIV编码的是一些形态蛋白。在基因II和IV之间有一个非编码区，508bp，集中了所有的顺式作用元件，即调控序列。丝状噬菌体的所有基因都是重要的，载体必须装有全部编码序列，外源DNA片段可以插入IR区域内。 * * 噬菌体 (phage) ? M13 单链噬菌体的增殖 M13进入大肠杆菌后 以滚环方式产生单链（+） 复制型 (replicative form) 双链环状结构 ? M13 DNA载体的构建 噬菌体 (phage) IR区域：共508个核苷酸，不编码任何基因，可用来插入外源基因。 IR区域 噬菌体 (phage) ? M13 DNA载体的特点 ① 使克隆的DNA片段以特定单链的形式输出受体细胞外 ② M13重组分子筛选简便 ③ M13-DNA载体的最大缺陷是装载量小，一般小于2kb ? M13 DNA载体的用途 ① 制备单链DNA用于双脱氧链终止法进行DNA测序 ② 制备单链同位素标记的杂交用DNA探针 ③ 利用寡核苷酸进行定点诱变 l-DNA载体和M13-DNA载体的装载量最大分别为25kb和2kb，但在很多情况下，往往需要克隆更大的外源DNA片段，在包装上限固定的条件下，只有大幅度缩短噬菌体DNA的长度，才能增加载体的装载能力。 将噬菌体DNA中与包装有关的序列与质粒组装在一起，构建成黏粒（cosmid）或噬菌粒（phagemid）不仅能提高噬菌体DNA的装载量，也能像质粒一样导入大肠杆菌并进行筛选，兼具了质粒和噬菌体两者的优点。 黏粒和噬菌粒 黏粒 (cosmid) 黏粒(cos质粒)的特点 能像l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞 ； 能像质粒那样在受体细胞中自主复制； 装载量大(45 kb)且克隆片段具有一定的大小范围； 操作简便，筛选容易； 不能体内包装，不裂解受体细胞； 人工构建的一类含有λ-DNA包装所必需的cos序列，以及质粒的复制序列、标志基因和多克隆位点的特殊载体。 1978年，Collins和Hohn将1.8kb的λ-DNA片段与pBR322质粒片段组合在一起，所构建的载体装载范围为31- 45kb。 cos site - carrying plasmid 黏粒 (cosmid) 噬菌粒 (phagemid或phasmid) 人工构建的一类含有单链噬菌体包装序列、复制子，以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体。 噬菌粒载体的特点 能像M13-DNA那样体外包装，并高效转染受体细胞 ； 能像质粒那样在受体细胞中自主复制； 装载量比常规的M13mp系列要大很多(10 kb) ； 通过克隆双链DNA能获得同等长度的单链DNA ； 操作简便，筛选容易； 噬菌粒 (phagemid或phasmid) pUC118/119 (pUC18/19 + M13间隔区） 重要的噬菌粒载体 pBluescript (pUC + f1-ori + PT7 + PT3） 病毒DNA载体 逆转录病毒载体 ? 逆转录病毒的生物学特性 逆转录病毒的基因组是一单链RNA分子，包裹在蛋白质外壳中。编码产物有外膜糖蛋白(env)、核心蛋白(gag)、逆转录酶(pol)等；非编码区有包装位点(ψ)、两端有长末端重复序列(LTR)等。 宿主细胞 DNA 宿主细胞 DNA 逆转录病毒载体 ? 逆转录病毒基因组的基本结构 逆转录病毒基因组序列 gag、env、pol序列 包装位点、部分LTR序列 转入适当的细胞 包装细胞或辅助细胞 (有大量的病毒蛋白，无病毒颗粒) 筛选 加入多克隆位点 和选择标记等 逆转录病毒载体 可形成复制缺陷的病毒颗粒 (能高效转染哺乳动物细胞，并将目的基因整合到宿主基因组上) 转入一般的哺乳动物细胞 (无法形成病毒颗粒) 逆转录病毒载体 ? 逆转录病毒载体系统 具有广泛的哺乳动物细胞宿主 能插入7kb或更大的外源基因 含有高效完整的调控元件 可以主动感染方式进入宿主细胞，并整合至宿主染色体基因组中，与宿主染色体一起复制并长期存在 需要相应的外包装，以形成完整的体系 逆转录病毒载体 ? 逆转录病毒载体的特点 ? 逆转录病毒载体的应用 是一种向真核细胞转移基因的有力工具，尤其是对于普通化学方法难以转染的细胞 局限性：装载容量有限、安全性问题 腺病毒载体 腺病毒科为线状双链DNA病毒，无包膜，呈二十面体，