2 微生物的菌种选育和保藏幻灯片.ppt

5 原生质体融合育种的应用 （1）陈宁等以球形芽抱杆菌和苏云金芽泡杆菌H4为亲株(前者对淡色库蚊有高毒力，后者对粘虫、玉米螟有高毒力)， 在2-3 mg/ml溶菌酶浓度下，42℃酶解45分钟，获得了原生质体，然后将获得的原生质体以1:1比例混合，加入40％的PEG于42 ℃保温5min， 结果获得了既杀双翅目又杀鳞翅目幼虫的融合子。 （2）在链霉菌原生质体融合育种方面 邢孔照等以巴龙霉素产生菌和新留素产生菌的高产变种营养缺陷型为亲株进行融合，产生原养型重组体的频率为10-4。 其中有58%产生巴龙霉素，并从中获得了产量比原始菌株(300ug/ml)提高5-6倍的融合子。 （2）在链霉菌原生质体融合育种方面 杨昭中等以四环素产生菌金色链霉菌和正定霉素产生菌天蓝淡红链霉菌正定变种为亲株进行融合，以自身抗生素抗性为标记选择种间融合子，从而获得了一株正定霉素产量较亲株提高了2.6倍的融合子。 原生质体 没有细胞壁； 细胞失去刚性，呈球形； 对渗透压敏感。 操作步骤 1、标记菌株的筛选： 选具有良好性状且具有稳定、明显的遗传标记（营养缺陷型、抗药性）菌株。 2、原生质体制备： 离心收集菌体，破壁，离心收集原生质体。 细菌和放线菌采用溶菌酶；酵母菌和霉菌用蜗牛酶和纤维素酶。 3. 原生质体融合 原生质体融合时，融合率较低，必须助融，主要有： （1）生物助融是通过病毒聚合剂，如仙病毒等。 （2）物理助溶剂是通过离心沉淀、电脉冲、激光、离子素等方法刺激与生体融合。 （3）化学助融是通过化学助融剂刺激起融合，现在使用最多的是表面活性剂PEG加Ca2+ 原生质融合会产生两种情况： （1）真正的融合，即产生杂合二倍体或单倍体重组体，称为融合子； （2）暂时的融合，形成异核体。 4. 融合子的检出与鉴定 重组子即融合子的检出方法有两种：直接法和间接法。 第三节 杂交育种 杂交育种：指人为地利用原核微生物中的接合、转化、转导及真核微生物的有性生殖和准性生殖等过程。促使两个具有不同遗传性状的菌株发生基因重组，以获得性能优良的生产菌株。 2.3.1 细菌的杂交育种 1. 接合（conjugation） 定义：供体菌（“雄”）通过其性菌毛与受体菌（“雌”）相接触，前者传递不同长度的DNA给后者，并在后者细胞中进行双链化或进一步与核染色体发生交换、整合，从而使后者获得供体菌的遗传性状的现象。 通过接合而获得新性状的受体细胞就是接合子。 + A+B+C-D- 维甲缺陷型 A-B-C+D+ 苏缺赖陷型 接 合 及 其 发 现 A+B+C+D+ 通过细胞间的直接接触能进行大 段ＤＮＡ的转移的过程，叫接合 在细菌中，接合现象研究得最清楚的是大肠杆菌。发现大肠杆菌有性别分化，决定它们性别的因子称为F因子（致育因子 ）。 （2）转化（transformation） 转化：受体菌直接吸收了来自供体菌的DNA片段，通过交换整合到自己的基因组中，从而获得部分新的遗传型状的现象。接受了供体菌DNA的受体菌称为转化子。 范围：原核生物中，转化是一个较普遍的现象。 若干放线菌和蓝细菌及少数真核微生物也有转化报道。 转化发生的条件 两个菌种或菌株之间能否发生转化，与它们在进化过程中的亲缘关系有着密切的关系。但即使在转化率极高的那些种中，其不同菌株间也不一定都可发生转化。 进行转化的受体细胞必须处于感受态，亦即受体细胞最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态。 感受态因子：一种细胞外蛋白，可与受体菌细胞表面的特异受体结合，结果激活细胞内一系列与转化有关的基因的表达，其中产生的自溶素使细胞表面的DNA结合蛋白和核酸酶裸露出来，以完成转化过程。 不同细菌，每个细胞上的DNA结合位点数不同。 转化因子的本质一般是DNA，经多次提纯操作后，每一转化DNA片段的分子量都小于1×107，约占细菌核染色体组的0.3%。 据研究，呈质粒形式的转化因子，其转化频率最高；一般的转化因子都是线状双链DNA；也有线状单链DNA具有转化作用的报道 受体细胞能接受转化的生理状态称为感受态，只有处于感受态的细菌才能接受转化因子，从出现到消失约为40分钟(对数期的中期)。 感受态 感受态出现原因 细菌失去部分细胞壁的结果 细菌在细胞表面产生某种酶引起 ①转化过程：以S. Pneumoniae为例分为六阶段： DNA的转化 ② 转化的特点： （a）对核酸酶敏感； （b）不需要活的DNA供体细胞； （c）转化是否成功及转化效率的高低主要取决于转化供体菌 株和转化受体菌株之间的亲源关系； （d）通常情况下质粒的自然转化效率要低得多 ③ 人工转化 用C