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PCR实验室标本管理、生物安全和防污染策略幻灯片
PCR实验室标本管理、生物安全和防污染策略广西壮族自治区人民医院检验科李友琼 标本采集时间对扩增检测结果的影响 在疾病发展过程中,标本采集过早或过晚都可能会给出假阴性结果。 标本采集部位的准备 标本采集部位的清洁消毒可去掉污染的微生 物或其他杂物,但应适度,过度清洁消毒有可 能会去掉或破坏靶微生物,故标本采集部位的 准备应由训练有素的人员进行。 标本的类型和采集量 标本的类型:血清(浆)、分泌物、痰、尿和脑脊液等。 标本的采集量:应根据所测病原体而定。一般来说,如果标本的量对病原体培养够用的话,则其量亦足以用于核酸提取及其后的扩增检测 对于定量检测来说,对标本的收集要求更为精确。 采集质量的评价 血清(浆)标本:溶血、脂血等; 分泌物、痰:评价评价内容包括细胞组成,所需类型细胞的数量和核酸总量。 评价方法:包括肉眼观察,显微镜下观察和化学分析等。 采样及运输容器 标本的采集材料如棉签应为一次性使用; 运输容器亦应为密闭的一次性装置; 采集所用的防腐剂、抗凝剂及相关试剂材料不应对核酸扩增及检测过程造成干扰。 标本采集中的防污染 采集中要特别注意污染,防止混入操作者的头发、表皮细胞、痰液等; 如使用玻璃器皿,必须经高温灭菌,以使用可能存在的RNase失活。 标本运送 容器的使用 二、全血标本 以全血作为 待测标本时 1. 抗凝剂的选择 以全血作为待测标本 时,一般使用EDTA-Na2或枸橼酸钠, 不可使用肝素。 2. 保存全血样本用于DNA提取检测,可 4℃下短期保存,如用于RNA检测, 则 应在取血后尽快提取RNA。 三、外周血单个核细胞 外周血单个核细胞可从抗凝全血制备,主要有两条途径,一是使用淋巴细胞分离液分离制备;二是使用红细胞裂解液,裂解全血中的红细胞,经生理盐水数次洗涤,即可看到单个核细胞。 保存 外周血单个核细胞如暂不提取核酸,可保存于-70℃下。 四、痰 特点 痰属于分泌物,痰标本中含有大量粘蛋白和杂质。 处理 1、如作结核杆菌DNA测定标本,提取核酸前,需对标本进行初步处理,即用 1mmol/LNaOH液化。需注意的是,液化时不能加热,液化时间不能过长。 保存 液化标本如不立即用于核酸提取,可保存于-70℃下。 2、如用于非结核杆菌如肺炎支原体的PCR检测,痰标本的处理只能室温悬浮于生理盐水中,充分震荡混匀,促使大块粘状物下沉,取上清离心,所得到的沉淀物即可用于核酸提取。 五、棉拭子 使用PCR方法检测性疾病病原体时,临床标本一般为棉拭子,可将棉拭子置于适量生理盐水中,充分震荡洗涤后,取上清立即离心,其后的沉淀即可用于DNA提取。 保存 如不立即用于核酸提取,则需保存于-70℃下。 六、脓液 脓液的处理依情况而定。 如用于分枝杆菌(如结核杆菌)核酸测定的标本,粘稠的脓液可采用痰标本的处理模式,先进行液化,再离心取沉淀提取DNA;水样的脓液则直接离心,沉淀用于生理盐水洗2-3次后,即可用于DNA提取。 对于用于非分枝杆菌测定的脓液标本,如过于粘稠,则加入适量生理盐水,充分振荡后,静置,取上清立即离心,沉淀用于DNA提取;如为水样,则按上述直接离心取沉淀即可。 保存 沉淀标本的保存条件同样为-70℃。 七、体液 临床体液标本包括胸水,腹水,脑脊液,尿液等,可按水样标本的方式直接离心取沉淀提取核酸。沉淀样本的保存同上。 八、组织 组织分新鲜组织块和石蜡切片。 新鲜组织块的处理步骤 首先用生理盐水洗两次,然后将其捣碎或切碎,加入生理盐水后剧烈震荡混匀,离心,弃上清,再加蛋白酶K消化后提取核酸。 保存 新鲜组织最好是保存于50%乙醇中,具体作法是,先用生理盐水将组织洗一次,切成宽度小于1cm的小片,加入适量的生理盐水,然后,边摇边加入无水乙醇至浓度为50%,这样固定的组织标本室温下可保存数日,4℃可保存6年。 保存 新鲜组织最好是保存于50%乙醇中,具体作法是,先用生理盐水将组织洗一次,切成宽度小于1cm的小片,加入适量的生理盐水,然后,边摇边加入无水乙醇至浓度为50%,这样固定的组织标本室温下可保存数日,4℃可保存6年。 石蜡切片用于核酸提取,需先用辛烷或二甲苯脱蜡,再用蛋白酶K消化后可进行DNA提取。 小结 1、标本的收集及适当的预处理,对用于PCR测定的核酸模板的成功提取,具有决定性作用。 2、要着重强调的一点是,所有用于上述临床标本收集的容器如试管或离心管,均应使用前高压灭菌。 PCR污染与对策 PCR反映的最大特点是具有较大扩增能
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