PCR扩增试验.PPTVIP

PCR扩增实验 原理： 利用特异的引物，以重组质粒pGEX-4T-1（His）6-C-X为模板扩增X基因。 扩增反应 1）扩增引物 2）模板：重组质粒pGEX-4T-1（His）6-C-X 3）PCR反应试剂盒（购置） 4）50×TAE缓冲液： 242g Tris碱 57.1ml 冰醋酸 100ml 0.5M EDTA H2O补充至1000 ml 5）6×凝胶加样缓冲液：0.25％溴酚兰，0.25%二甲苯青FF，40%蔗糖，4℃保存 6）溴化乙锭保存液：10mg／ml，避光保存 7）0.8％琼脂糖凝胶：0.8克琼脂糖加热溶于100 ml 1×TAE。 1)按以下次序，将各成分在0.5ml灭菌离心管内混合：(100ul) ddH2O 79ul 10×扩增缓冲液 10ul 4种dNTP混合物， 2ul (终浓度为0.2mmol／L) MgCl2 6ul (终浓度为1.5mmol／L) 引物1 1ul (终浓度为50pmmol／L ) 引物2 1ul (终浓度为50pmmol／L ) 模板DNA 1ul 2)100℃加热反应混合液10分钟，冰浴5′，使DNA完全变性。 3)将1ulTaqDNA聚合酶(5单位/ul)，加入反应混合液中。 4)用100ul石蜡油覆盖于反应混合液之上，防止样品在反复加热-冷却的过程中蒸发。 5）按以下方法进行PCR反应： 常用循环参数：①变性：94℃ 1分钟、②退火：55℃ 1分钟、③延伸：72℃ 1分30个循环。 6)制备1.5％琼脂糖凝胶板：将1.5％琼脂糖凝胶置微波炉中溶化,稍等冷却，倒入制胶槽中，充分凝固后拔出样品梳； 7)将凝胶板放人电泳槽，加入1×TAE缓冲液，使液面略高于凝胶。 8)从反应混合液中取出DNA扩增产物2 ul并加1ul 6×凝胶加样缓冲液，混匀后全部加入凝胶板的样品孔中进行电泳。 9)电泳100V约1小时； 10)在500 ml 水中加入溴化乙锭保存液, (EB终浓度0.5-1ug/ml),混匀； 11)将疑胶轻轻滑入染色液，染色20-30分钟； 12)取出凝胶，用水稍漂洗； 13)紫外灯下确定DNA区带。 由于PCR能够使DNA分子大量扩增，所以应当注意防止反应体系被痕量DNA模板污染(Kwok和Higuchi，1989)。尤其在待扩增靶序列浓度低的情况下，更有必要采取防备措施。 1)在装有紫外灯的层流式工作台内吸加PCR试剂和进行反应。不用时应打开紫外灯。工作台内应配置有PCR专用的微量离心机、一次性手套、整套移液器和其他必需品。自动移液器的管部是常见的污染源，配液和移液时应当使用一次性吸头和活塞的正向排液式移液器。所有缓冲液、吸头和离心管使用前必须经过高压处理。 2)准备成套试剂，分装为小份，在靠近工作台的冰箱中设立专门位置来保存。配制试剂时，用从未接触过任何DNA的新玻璃用具、塑料用具和移液器。使用后将这一小份全部废弃，不得重新置存。 3)装有PCR试剂的微量离心管打开之前，应先在专用工作台内的微量离心机上作瞬时离心(10秒)。使液体沉积于管底，减少污染的机会。 4)加完所有其他反应成分、包括防止蒸发用的矿物油后才吸加模板DNA。模板加入微量离心管后，盖好离心管并用戴有手套的手指轻轻弹击管侧壁，混匀液体。再作瞬时离心(10秒)，使水相和有机相分开。 5)将模板DNA加入PCR系统时，注意切勿形成喷雾，后者有可能污染别的反应。并非即用管都应盖严。拿过模板DNA管后应更换手套。 6)应设置阳性对照反应(即由少量适当的靶序列参与的PCR)。对靶序列的稀释工作应于实验前在实验室内别的位置进行，防止将靶DNA的浓溶液带到实验室中专门进行PCR的位置。 7)必须设置一个不含模板DNA但含有PCR系统中所有其他成分的对照反应，这一对照管