不同标准中单增李斯特氏菌的检测方法蔡向荣青岛高科园海博生物.PPT

不同标准中单增李斯特氏菌的检测方法 蔡向荣 青岛高科园海博生物技术有限公司 以下比较不同标准中单增李氏菌的检测方法： 一、FDA的检测方法 通用检测方法 1、样品制备 样品混合液的制备: 无菌操作从10个样品中各取50ml或50g,每五种样品混合成一份250ml或250g,共分两份(注意取样要均匀).两份混合液都加入250ml的BLEB,振荡混匀.每份样品匀液各取50ml(固体取25ml)分别放入200ml BLEB中,同时再各取50ml(固体取25ml)置于5℃冰箱中保存,以备计数. 非混合液的制备: 若不需要样品混合物,则只需取25g样品放入225ml的BLEB中,混匀,增菌培养.同时贮存25g样品以备计数.非冷冻样品,应置于5℃下保存;冷冻样品置于保鲜冰箱中保存,不能冷冻. 2、前增菌培养和增菌培养 在BLEB 增菌液中30℃培养4h后，加入选择性试剂,继续30℃培养48h.若没有放线菌酮,也可用25mg/L的匹马菌素代替,且比放线菌酮更安全.巴氏消毒乳、乳制品、酸乳酪、冷冻水产品等,含有较少的酵母菌和较少霉菌,因此不需加入抗菌剂.但生乳、干的海产品或新鲜产品则需加入抗菌剂. 在增菌培养中，所使用的培养基为缓冲李斯特氏菌增菌液(BLEB)。是否能检测出单增李斯特氏菌，培养基的质量至关重要。好的增菌液接种10个单增李斯特氏菌，通过增菌培养24-48小时，可增菌到1-10亿个菌/ml；不好的增菌液仅能增菌到1万个菌/ml，若有杂菌干扰便不能分离出目标菌。本公司对比了不同厂家的李氏菌增菌液，足可说明此问题。通过下表说明，我公司的EB增菌液可增菌到10-8，国内厂家仅增菌到10-4、10-5，国外增菌到10-8。AOAC实验表明,增菌液菌浓度10000cfu/ml,平板培养大约100cfu/ml.因此,若增菌液中菌浓度太低,试验结果可能会给出错误的阴性结果. 不同厂家李氏菌增菌液的对比试验 3、选择性分离培养 在24和48h时,挑取BLEB上的菌落划线接种于任何一种含七叶苷的选择分离培养基上：OXA、PALCAM、MOX或加入七叶苷和三价铁的LPM。以上含七叶苷的培养基根据具体要求而选用。OXA、PALCAM、MOX平板接菌后放置于35℃培养24-48小时，含七叶苷和三价铁的LPM平板接菌后放置于30℃培养24-48小时。特别推荐以下单增李斯特氏菌与绵羊李斯特氏菌所用的选择性显色培养基，例如BCM、ALOA等培养基培养48小时( 也可培养24小时)，这样可以减少绵羊李斯特氏菌掩盖单增李斯特氏菌。 在含七叶苷的培养基上，李氏菌呈黒色，菌落周围具有黒色的环。一些其它的细菌在两天以后或更长的时间，能够形成淡棕黒色的菌落。 从OXA、PALCAM、改良LPM培养基或MOX培养基上， 挑取5个典型菌落划线接种到TSAye培养基上，分离纯化单菌 落。同样也可划线接种到BCM培养基，单增李斯特氏菌呈蓝 色，而绵羊李斯特氏菌在食品中不常见。单增李斯特氏菌和 绵羊李斯特氏菌在ALOA培养基下都呈蓝色且在菌落周围有酯 酶环。在传统的检测方法中，利用TSAye培养基进行菌落纯 化是必须的，因为选择性培养基上分离出的菌落仍有可能包 涵有其它细菌。至少挑取5个菌落，由于在同一样品中可能含 有几种李斯特氏菌。BCM和ALOA培养基可以减少挑取的菌 落数。运用商业的Confirmatory培养基，或传统的木糖/鼠李 糖发酵肉汤或琼脂，可以区别单增李斯特氏菌和绵羊李斯特 氏菌。TSAye平板需在30℃培养24-48小时，若不需观察运 动，也可在35℃培养。 从上面FDA的方法中，可知所采用的选择性分离平板为 OXA或PALCAM或MOX或改良LPM培养基，从中选取一种 即可，同时FDA特别重点推荐采用李斯特氏菌显色培养基。 李氏菌在OXA上 4、确证试验 检测TSAye平板上的典型菌落形态，用斜射光观察是非常有帮助，但不是必须的。 从30℃或低于30℃培养的平板上挑取生长良好的典型菌落，涂于洁净载玻片上，用0.85%生理盐水制成悬浮液，压上盖玻片于相差显微镜的油镜下观察。李斯特氏菌为短杆状，有轻微的旋转和翻滚运动。而大的杆状，或快速运动的杆状细菌则不是李斯特氏菌。应用阳性的李斯特氏菌做对照。 过氧化氢酶试验：李斯特氏菌阳性反应。 革兰氏染色试验：将培养16-24小时的培养物进行染色。李斯特氏菌呈短杆状阳性菌。但若培养时间过长，染色会发生变化。细胞呈现Coccoidal菌现象。着色轻的部位呈现栅栏状，被当作类白喉菌排除掉。 挑取典型菌落接种到TSBye培养基(进行糖发酵试验)