DNACPG合成书说明书-专利.pdf

NN201409002 说 明 书 DNA CPG 合成柱说明书 技术领域 本实用新型属于DNA 合成的工具或者耗材。 背景技术 随着分子生物学技术的发展，包括药物研发、遗传病和感染性疾病诊断、基因研究、聚 合酶链式反应(PCR)和杂交试验都需要大量的DNA 片段，这些DNA 片段大都需要人工合成。 DNA 合成的片段常常有不同的表述方法，比如寡核苷酸、PCR 引物、接头、探针、短链引物 和长链引物等(逗点生物）。 DNA 合成过程简述如下，此种方法一般合成短链的 DNA ，通常20bp ，少数长度可达 150bp。 第一步是将预先连接在固相载体上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其 5′-羟基的保护基团DMT ，获得游离的5′-羟基。 第二步，合成 DNA 的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核 苷亚磷酸活化中间体，它的3′端被活化，5′-羟基仍然被DMT 保护，与溶液中游离的5′-羟基 发生缩合反应。 第三步，带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5′-羟基没有参加反应(少于2%) ， 用乙酸酐和 1- 甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在后续环节根据实验需要来 选择纯化方式分离掉。 第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。 经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体（通常是CPG ）的核苷酸上。再 以三氯乙酸脱去它的 5′-羟基上的保护基团 DMT ，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基 被接上去。合成过程中可以观察TCA 处理阶段的颜色判定合成效率。通过氨水高温处理，连 接在CPG 上的引物被切下来，通过OPC、PAGE 等手段纯化引物，成品引物用C18 浓缩，脱 盐，沉淀。沉淀后的引物用水悬浮，测定OD260 定量，根据要求分装。 全基因合成。全基因合成是在短链 DNA 的基础上，拼接而成。具体方法为，将双链基 因分成若干短链DNA 片段，每个片段长度控制在 40～100 个碱基，并使每对相邻互补的片 段之间有大约 6 个碱基交叉重叠。在体外去除基因两端末端外的所有片段磷酸化。混合退火 后加入DNA 连接酶，即可得到较大的基因片段。 1 NN201409002 说 明 书 要完成DNA 合成，除需要DNA 合成仪外，还需要DNA 合成柱和合成试剂，试剂包括 乙腈等流动相以及核苷酸单体等。 经典的 DNA 合成柱，包含固相载体、筛板和空柱管。固相载体通常用控制孔径的玻璃 球（Controlled Pore Glass，简称CPG ），CPG 球体内部有很多不规则的孔道，孔道的大小称 为孔径，通常选择孔径500Å 和 1000Å 的CPG 用于DNA 合成，也可以选择其它孔径。筛板 通常用UHMW-PE 或HDPE 粉末烧结而成。UHMW-PE 粉末在一定的温度下处于半融化状态， 颗粒之间搭桥形成一定的孔径。在DNA 合成中，筛板的作用是阻挡CPG 不漏下来而合成试 剂能够通过。空柱管为聚丙烯注塑而成。 专利US201010183488 和US7691316B2 公开了另一种DNA 合成柱。此种合成柱由CPG Frits 和空柱管构成。CPG Frits 是CPG 和UHMW-PE 或HDPE 粉末烧结成。UHMW-PE 颗粒 包裹并固定CPG 颗粒，UHMW-PE 颗粒之间搭桥形成一定的孔径。流动相在CPG 内部的孔 和UHMW-PE 颗粒之间的孔中流动，完成各种化学反应。CPG Frits 直径3.9mm，厚度为6mm、 9mm 和 12mm。CTGen 公司推出的CPG Frits，直径为3.9mm ，厚度/合成量为5.5mm/200nmol， 4.0mm/100nmol 和2mm/25nmol。 和经典的DNA 合成柱比较，CPG Frits 合成柱是