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A549细胞培养方法
A549细胞的培养
A549细胞为人肺腺癌细胞,属于传代细胞系,可稳定地传代培养。一般用胰酶消化后,加入生长液稀释,以12~1:3传代培养都是可行的。
一[所需溶液]
1、细胞冲洗液:磷酸盐缓冲液PBS)——无Ca、MgNaCl 8.00 g;
KC 0.20 g;
KH2PO4 0.20 g;
Na2HPO4·12H2O 1.15 g
加水至1000mL将H调至7.4,高压灭菌。
2、消化液
胰酶-PBS
结晶胰酶 2.5 g;
高压灭菌后的PBS 1000 ml
用磁力搅拌器搅拌均匀,使其完全溶解,通过0.22 μm的滤膜过滤除菌,分装备用,放置20℃保存。
胰酶—EDTA:
结晶胰酶 0.5 g;
EDTA盐溶液 0.2 g
无Ca2+、Mg PBS 1000 ml
用磁力搅拌器搅拌均匀,使其完全溶解,通过0.22 μm的滤膜过滤除菌,分装备用,放置20℃保存。
3、细胞培养液:RPMI 1640培养液
配制方法:
将一袋干粉型RPMI 1640培养基溶于900 ml三蒸水中,冲洗包装袋两至三次倒入培养液中。
加入丙酮酸钠 0.1 g,NaHCO2 2 g以及双抗,加入磁力搅棒并置于磁力搅拌器上充分搅拌。双抗的配置浓度为 100 U/ 青霉素和100 U/链霉素。一般市售的青霉素为80 万U/瓶,将其溶解于4 ml三蒸水中,每升培养液中加入0.5 ml;市售的链霉素为100 万U/瓶,将其溶解于5 ml三蒸水中,每升培养液中加入0.5 ml。
调整培养液的值,用精密试纸观察即可。
过滤法除菌,所使用的滤器为加压过滤,μm滤膜,滤膜事先采用高压灭菌消毒。
分装,加盖瓶塞,加封纱布报纸,用绳固定,放置20℃保存。
二、[细胞的维持和培养]
1、细胞的复苏
准备一个盛有℃温水的烧杯,从液氮罐中取出存有细胞的冻存管,放于℃温水中,用镊子夹住轻轻摇动使其迅速融化。
1000~2000 r,3min离心。
在无菌操作台中采用75%的乙醇彻底擦拭冻存管,然后打开冻存管,注意动作要轻柔。
用1 ml枪头将上清液去除,加入1 ml预热的细胞培养液将细胞吹散开,转移至25cm2培养瓶中。
补充4 ml的RPMI 1640培养基,并且添加10%的胎牛血清。
倒置显微镜下观察,37℃、5%CO2培养。
24h后,更换新的培养液。
常规传代培养。
A549细胞更换新的培养液
无菌操作打开培养瓶瓶盖,倒掉培养液。
用PBS反复冲洗细胞23遍。
加入新鲜的预热好的培养液及10%的胎牛血清。
各种液体需要量(ml)
表面积 25 cm2 75 cm2 150 cm2 洗涤 3 5 10
胰酶 12 1~3 2~5
培养液 5 10 20 倒置显微镜下观察,37℃、5%CO2培养。
3、A549细胞的传代
无菌操作打开培养瓶瓶盖,倒掉培养液。
向已经长满的细胞中加入消化液1 ml,轻轻摇动培养瓶,使消化液流遍所有的细胞表面,吸弃或倒掉,轻轻冲洗细胞表面2遍,以尽可能去除原培养液中的牛血清。
加入1 ml消化液,在37℃培养箱中孵育5min后把培养瓶放置在倒置显微镜下观察,发现细胞的胞质回缩、胞间质增大后,立即终止消化。
加入5 ml预热至37℃的培养液,用玻璃吸管反复吹打以分散细胞。吹打过程按顺序进行,从培养瓶底部一边开始到另一边结束,以确保所有的底部都被吹到。
吸取一半的细胞悬液,接种到新的25 cm2培养瓶中,补足培养液,并且添加10%20%的胎牛血清。通常每瓶液体量为510 ml。
倒置显微镜下观察,37℃、5%CO2培养。
注意事项:
所有液体在加入细胞瓶前均应预热到37℃。所有液体均应调整H至7.2左右,均不能超过7.4。
细胞消化传代时吹打不要产生气泡,吹打力量不宜过多,否则会损伤细胞。
严格执行无菌操作的要求。
尽可能减少消化液剩余量,过多时会对细胞产生损伤,可多添加些含牛血清的培养液中和。
培养瓶在室温中放置时间应尽可能短。
4、A549细胞的冻存
消化已生长融合的单层细胞。
用生长液悬浮细胞,并且添加10%的FCS和10%DMSO二甲基亚砜。分装在2 ml容积的冻存管中。
用本实验室自制的冻存包包裹好冻存管,放在-70℃冰箱中过夜。
放入液氮中冻存。
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