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miRNA研究方法 尽管早在1993年，科学家就发现了第一个microRNA，但直到2003年以后，这种小RNA分子的大作用才不断被发现。研究显示：miRNA通过与转录本的相互作用，关闭或抑制基因的表达，影响了30%的基因。miRNA在多个组织中，例如正常和肿瘤组织中差异表达。因此，通过表达谱分析寻找疾病相关miRNA并进行发病机理研究，最终应用于肿瘤诊断和治疗，已经成为目前miRNA研究的重要方向。在研究中，从深度测序、miRNA芯片到通过导入化学合成的mimics/antagomirs等实现miRNA过表达和抑制，都是研究中常用的方法。同时，在miRNA研究中，生物信息学分析扮演着越来越重要的角色。 下表介绍了miRNA研究和应用中科学家关注的主要科学问题以及目前常用的研究方法。 问题 目的 研究方法 应用 有哪些miRNA表达？ miRNA表达情况 深度测序生物信息学分析 生物信息学分析预测可能的miRNA，进一步验证 发现新的候选miRNA miRNA何时表达？在哪里表达？表达差异？ miRNA表达特征 miRNA芯片，磁珠流式细胞miRNA表达谱 qPCR对hit miRNA进行验证，Northern Blot，原位杂交等 发现差异miRNA，为进一步功能研究、诊断，预后判断，疗效检测等奠定基础 miRNA控制哪些基因？这些基因功能？所在信号通路？ miRNA功能分析 生物信息学分析 qPCR对hit mRNA进行验证，Western Blot等方法检测蛋白表达水平 转入miRNA mimics观察相应mRNA蛋白水平变化以及相关现象（miRNA低表达情况） 转入miRNA antagomirs观察相应mRNA蛋白水平变化以及相关现象（miRNA低表达情况） 机理研究，功能研究 miRNA如何控制靶miRNA 确定结合位点 生物信息学分析miRNA结合靶mRNA 3UTR的可能序列 构建包含miRNA结合位点（3UTR）以及位点突变的萤光素酶报告载体进行验证 机理研究 miRNA功能（与特定疾病、表型的关系） miRNA功能分析 细胞水平：过表达及抑制实验（见前），观察表型及现象变化以及上下游通路变化 动物模型：过表达及抑制实验（见前），观察表型及现象变化以及上下游通路变化 临床组织样本，检测miRNA表达情况与疾病相关性 功能研究 miRNA应用于诊断 诊断 选择疾病相关的一个或一组miRNA，或结合其它基因水平变化，进行q-RCR等检测 诊断，预后判断，疗效检测 miRNA应用于治疗 治疗 转入合成的小分子miRNA模拟物（miRNA低表达情况）或拮抗剂（miRNAG高表达情况） 治疗 miRNA主要研究技术 深度测序 抽提分离小分子（例如18-30nt）RNA，通过RT-PCR扩增之后，利用solexa深度测序，并进行生物信息学分析，获得miRNA表达谱。深度测序结合生物信息学分析手段，可以对海量数据进行分析，分别统计出已知的miRNA（miRNA-known）、新的miRNA（miRNA-new）以及可能的新miRNA（miRNA-cadidate new），并对新发现的miRNA进行靶基因分析，功能预测等。通过深度测序的方法，可以发现新的miRNA，为进一步的深入研究奠定基础。 miRNA芯片 利用miRNA芯片（例如Agilent miRNA芯片），可以高通量分析miRNA表达的时空特异性、不同样本（例如癌组织和癌旁组织）中miRNA的差异表达，进而进行把基因分析，功能注释、通路分析，网络分析等，以了解miRNA在疾病发生中的作用。与深度测序不同，miRNA芯片针对已知miRNA进行研究。筛选到的差异miRNA可以利用q-pCR进行验证。 q-PCR q-PCR技术可以用来检测miRNA以及其靶mRNA和相关mRNA等的检测，主要方法有茎环法和加尾法等。前者针对特定miRNA设计引物，特异性好，然而成本较高，周期长；后者采用通用引物，时间短，通量较大。 (欧易生物为您提供以上项目的优质服务，详情请关注：) Mimics以及Antogomirs 通常基因功能研究常常采用过表达或干涉（抑制、敲除）等方法，miRNA研究也不例外。通过导入化学合成的小分子miRNA mimics或拮抗miRNA 的antagomir，观察靶mRNA及编码蛋白表达以及细胞、动物水平的表型变化，进行信号通路研究，是目前miRNA功能研究的常用方法。 萤光素酶报告系统 在确定了靶mRNA之后，找到位于3-UTR区的miRNA结合位点是研究者下一步关心的内容。通过生物信息学分析获得候选的miRNA结合区域，将野生型和结合位点突变的3-UTR序列克隆入商品化的萤光素酶报告载体（例如pMIR-REPORT? miRNA E