proteinaproteing与抗体的结合..docx

Protein?A?、Protein?G?与抗体的结合1 Protein A Sepharose、rProtein A Sepharose亲和层析介质与抗体的结合目前，约70-80%的抗体纯化使用Protein A、Protein G 亲和层析。蛋白A (Protein A) 来源于金黄色葡萄球菌的一个株系，它含有5个可以和抗体IgG分子的Fc段特异性结合的结构域。蛋白A作为亲和配基被偶联到琼脂糖基质上，可以特异性的和样品中的抗体分子结合，而使其他杂蛋白流穿，具有极高的选择性，一步亲和层析就可达到超过95%的纯度。1个蛋白A分子至少可以结合2个IgG。蛋白A也可以结合另一些免疫球蛋白，如用于某些种属的IgA、IgM的纯化。天然 (Native Protein A) 和重组的蛋白A (rProtein A) 对于IgG的Fc段有着相似的特异结合。重组的蛋白A经改造后含有一个C末端半胱氨酸，可以单一位点偶联于琼脂糖上，降低了空间位阻，增加了与IgG的结合能力。蛋白A 与IgG的结合强度很大成度上依赖于该抗体的种属和亚型，而其动态结合能力则决定于结合强度 (解离常数) 及传质阻力等多种因素(例如上样时样品在柱内的停留时间)。2 Protein G Sepharose亲和层析介质与抗体的结合蛋白G是一种源自链球菌G族的细胞表面蛋白，为三型Fc受体。其通过类似于蛋白A 的非免疫机制与抗体的Fc段结合。像蛋白A 一样，蛋白G可以与IgG的Fc区域特异性结合，不同的是，Protein G Sepharose可以广泛、更强地结合更多类型的IgG, 多克隆IgG及人IgG，同时血清蛋白结合水平更低，纯度更高，配基脱落也相对更低。此外，蛋白G还可以和某些抗体的Fab和F (ab’)2 段结合。Protein G是从G类Streptococci细菌中分离出来的胞壁蛋白，与多数哺乳动物的IgGFc段结合(包括：人、山羊、绵羊、兔、豚鼠、马、猪、猴、小鼠等)，分子量：25kDa。Protein G可用于纯化不能与Protein A很好结合的哺乳动物单抗和多抗IgG的纯化。相对于Protein A，Protein G对于大多数哺乳动物的IgG有着更高的亲和力，尤其是对于IgG的亚基，如人 IgG3，小鼠IgG1和鼠 IgG2a。与Protein A不同，Protein G不与狗IgG结合、不结合人IgM，IgD，或IgA。? 重组蛋白G(Recomb Protein G)已经除去了与白蛋白及细胞表面结合位点，减少了交叉反应和非特异性结合。因此，它比天然蛋白G和蛋白A有更大的亲和力。可以代替二抗，广泛应用于免疫化学等领域。在亲和力、稳定性等方面好。本产品将我公司自主设计和生产的新型重组蛋白G偶联到环氧活化的琼脂糖凝胶6B上，成为用于抗体分离纯化的亲和层析介质本产品稳定性好，基团脱落少，使用寿命长，使用方便，可从腹水或培养液中直接分离纯化抗体。由于采用了环氧活化的方法，与溴化氰活化方法相比，可获得长短更适合的结合臂，使抗体纯化获得更好的效果。并且这种方法活化的琼脂糖凝胶没有离子交换的作用，因而其死吸附少。二、亲和介质特性：?特点基团脱落少，结合特异性强基质6% 的交联琼脂糖凝胶配基重组蛋白G配基密度≈6mg 重组蛋白G/ml吸附载量3-7mg 鼠IgG2a/ml亲和介质的颗粒大小50-160μm最大流速200cm/hpH 范围3-10 ，在位清洗时pH 范围可到2-11使用温度常温保存温度+4~8℃保存液体20% 乙醇?三、适用范围Protein A和Protein G的相对结合强度?物种物种亚类亚类protein A 结合protein G 结合人lgA可变-?lgD--?lgD--?lgG1++++++++?lgG2++++++++?lgG3-++++?lgG4++++++++?lgM可变-鸡蛋黄lgY--牛?++++++狗?+++山羊?-++豚鼠lgG1+++++?lgG2+++++仓鼠?+++马?++++++考拉?-+骆驼?-+猴(恒河)?++++++++小鼠lgG1+++++?lgG2a++++++++?lgG2b++++++?lgG3+++++?lgM可变-猪?++++++兔?+++++++大鼠lgG1-+?lgG2a-++++?lgG2b-++?lgG3-++绵羊?+/-++++++ =强结合，++ =中等结合，- =弱或不结?四、 缓冲液配制建议采用磷酸缓冲液，洗脱后不影响下游的标记。A缓冲液???1mol/L? Na2HPO4.12H2O(MW358.14)……………… 358.14g?1500 mMNaCl l(MW68.08g/mol) ………………… 87.7g???? ??????溶于1升水，滤膜过滤?B缓冲液? ??1mol/L