常见细胞实验流程.doc

实验前准备 根据自己实验的情况提前预定超净台 进入细胞室之前必须穿鞋套，戴手套 将实验所需要的实验仪器放入超净台内紫外照射灭菌15-20min 高压灭菌操作 将所需灭菌的枪头，EP管等仪器放入枪头盒或饭盒中，并用报纸将枪头盒包好。 将仪器放入灭菌锅之前，首先要检测一下锅内的水位是否超过锅底的圆圈，若没有超过则需加水。 检测水位之后，将包好的器材放入锅内，盖上锅盖并拧紧螺丝。 插上电源，先将电压调至250V，目的在于排尽锅内的空气，（当排气阀有白气冒出时，说明空气已排尽）空气排尽后，关闭排气阀。 关闭排气阀后指针上升，当指针竖直时，将电压调至125V，保持锅内压力的稳定。 开始计时，灭菌30min。结束时关闭电源，等至指针慢慢降下即可。 拿出锅内的器材放入恒温烘箱中烘干，2天后即可拿出。 （组织内）蛋白质提取过程 对癌组织和癌旁正常组织进行称重，记录数值。 根据RIPA裂解液Ⅲ说明书（每100mg组织中加入1ml溶液A，1ul溶液B，5ul溶液C）按照组织块得大小配好ABC混合液。 将组织块加入匀浆器中，并加入相应量得ABC混合液，冰上静置5-10min，开始研磨。 将研磨好的组织液倒入事先准备好的EP管中，12000rpm/5min. 离心结束后，收集上清液，弃去沉淀，上清即为所要的蛋白。 蛋白质浓度测定 取96孔板冲洗干净后超声处理30min,之后用去离子水冲洗干净烘干即可 2、配制BCA标准蛋白液： 浓度 原液体积 去离子水体积 A管： 2000ug /ul 30ul 0ul B管： 1500ug/ul 37.5ul 12.5ul C管： 1000ug/ul 25ul 25ul D管： 750ug/ul 18.75ul 31.25ul E管： 500ug/ul 12.5ul 37.5ul F管： 125ug/ul 3.125ul 46.875ul G管： 25ug/ul 0.625ul 49.375ul H管： 0 0ul 50ul 取8个EP管，分别标上以上字母，并按上表加入相应的原液蛋白和去离子水 先向96孔板内加入200ul的绿色底物溶液（根据实验计算所需要用孔的个数加入底物液） 加完后，将配好的A,B,C,D,E,F,G,H标准液10ul按照96孔板上第1列上的字母标记依次加入 之后在其他的孔内加入10ul蛋白样品（每个样品应重复2次） 加好样品后取保鲜膜将96孔板封闭好，以防止蛋白浓度发生变化，之后将板放入保温箱中静置30min 30min后将96孔板拿出放入测量仪器内（应按照仪器使用说明进行操作） 数据测完后另建文件夹，保存数据，之后插入尤盘拷取数据 在获得的数据结果中，根据BCA的标准蛋白浓度梯度值和560nm下对应的OD值计算可得出一个OD值与浓度相关的标准曲线：y=ax+b（计算机上操作） 将测得的蛋白样品的OD值带入公式，即可求出蛋白样品的浓度 若实验有实验组和对照组，应将两组的蛋白浓度标准化，即是两组的蛋白浓度相同（相同浓度下的两组实验才具可比性） 将浓度标准化的样品蛋白与loading buffer 混匀至100ul（混合液中loading buffer应为1X的，但实验室的一般为5X），稀释方法：取20ul 5Xloading buffer +80ul 样品蛋白混匀即可 在加样做western blot之前，蛋白样品需变性： 将与loading buffer混匀好的蛋白样品放入100度金属浴内高温变性10min（EP管上要加帽以防止温度过高EP管盖会冲开） （组织内）RNA提取过程 将组织放入匀浆器中，加入1ml的Trizol，冰上静置10min，进行研磨。 将匀浆好的上清转移至1.5ml EP管中，进行离心12000rpm/5min. 离心后收集上清液于新的EP管中，加入200ul氯仿，剧烈摇匀后静置5min，然后12000rpm/5min. 离心后取上清于另一新的EP管中，取液时不要取到中间层的蛋白。之后按1:1的比例加入异丙醇，摇匀后静置15min，进行离心12000rpm/10min。 离心后倒掉上清（可看到白色RNA沉淀），加入1ml 75%乙醇DEPC水溶液温和震荡，悬浮沉淀，3000rpm/5min. 倒掉上清，在滤纸上空干。然后加入20ul DEPC水溶解沉淀，并吹打均匀