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蛋白质组学主要研究技术.doc

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蛋白质组学主要研究技术

蛋白质组学主要研究技术 目前蛋白质组学的研究手段主要依靠分离技术、质谱技术和生物信息学的发展。分离技术要求达到高分辨率和高重复率,质谱技术主要包括 MALDI-TOF、Q-TOF与MS/MS等质谱设备以及样品的预处理,生物信息学则利用算法的改进和数据库查询比对的完善提高数据结果的判断。目前蛋白质组学研究广泛采用的是双向电泳技术。高通量性、对实验要求低、操作简便快速是双向电泳具有的最大优点,它特别适合大规模的蛋白质组学研究。尽管当前蛋白质的分离技术多种多样,但目前仍然没有一种可以彻底地取代双向电泳技术。 从1975年,O’Farrells[]等将IEF与SDS结合创立了2D电泳技术以来。双向电泳技术在多个方面都得到了提高和改进(1) IPG胶条的使用。传统的载体两性电解质等电聚焦存在上样量小、长时间电泳过程中pH梯度不稳定、阴极漂移现象及其导致的碱性蛋白损失、不同批次间重复性差等问题。IPG胶条的使用使这些问题得到了极大的改善,这使蛋白质双向电泳数据库的建立成为现实;(2) 样品制备:蛋白质样品的质量好坏从根本上决定了电泳最终结果的好坏。双向电泳的样品制备有两个关键点,即如何使样品中蛋白质充分溶解以及尽可能减少影响等电点聚焦的杂质,特别是带电杂质。采用超声或核酸酶处理的方法可以去除核酸,超速离心可除去脂类和多糖,透析、凝胶过滤或沉淀/重悬法可以降低盐浓度。近来的研究发现磺基甘氨酸三甲内盐(ASB14-16)的裂解效果最好,而2mol/l的硫脲和4%的表面活性剂CHAPS的混合液能促使疏水蛋白从IPG到第二相胶的转换。以三丁基膦(TBP)取代β-巯基乙醇或DTT,可以完全溶解链间或链内的二硫键,增强了蛋白质的溶解度,并促进蛋白质向第二向的转移。 另外,双向电泳中对低丰度蛋白的分离识别比较困难,除了显色技术的局限外,还存在容易被高丰度蛋白掩盖的问题,这样得到的蛋白质图谱很不完整,经常会忽略那些在生命过程中发挥重要功能的微量活性分子。解决方案包括增加上样量、对样品进行分级纯化从而富集低丰度蛋白、采用更高灵敏度的显色方法,如同位素标记等;(3) 电泳过程的完善:不同厂家,不同pH值范围的胶条都配有相应的样品处理方法及样品处理液,电泳参数可以预先设置并自动完成,这些都使电泳质量能得到保证,重复性也得到提高;Herbert等对电泳过程中的烷基化操作进行了详尽的研究,认为在样品制备时就应该完成烷基化作用,而不是在一向至二向之间的平衡阶段完成,这样有利于消除蛋白聚合物在碱性区域的产生并促进碱性蛋白的分离。质谱技术的基本原理是样品分子离子化后,根据不同离子间的质荷比(m/z)在真空系统中飞行速度的差异来分离并确定其分子量。它可以在数秒内打断肽段,并保持极高的灵敏度,而且操作简便。离子化技术的方法主要有两种,均为软离子法,一是采用基质辅助的激光解吸离子化(Matrix assisted laser desorptionionization,MALDI),即样品分子电离时, 保留整个分子的完整性, 不会形成碎片离子。MALDI结合时间飞行检测器(Time of Flight, TOF)成为MALDI-TOF,是生物质谱技术的常用方法,通常被称为肽质量指纹图谱(PMF);另一种为电喷雾离子化(Electrospray ionization,ESI),此法由离子谱推得多肽的氨基酸序列, 并依据这些氨基酸序列进行蛋白质鉴定, 因此较肽质量指纹分析鉴定更准确、可靠。上世纪90年代末期在以上离子化技术基础上, 将两个或更多的质量分析仪被组合起来,如MALDI-Q-TOF[]、 MALDI-TOF-TOF、MALDI/nano-LC-Q-TOF的出现,使质谱得到更好的质量精度、分辨率和灵敏度。(1) MALDI-TOF-MS基体辅助激光解析电离 (MALDI)是由德国科学家Karas和Hillen Kamp发现的, 它采用短激光脉冲(1-10ns)使样品分子离子化,导致蛋白质的电离和气化电离,然后由高电压将电离的蛋白质从离子源转送到质量分析器内,样品的离子化需要样品与基体混合(1:1000-1:10000为合适摩尔比)形成共结晶薄膜,基体吸收了激光的能量跃迁到激发态, 产生的质子转移到生物分子上,从而使生物分子电离。样品离子在电场作用下加速飞过飞行管道,根据到达飞行时间检测器(Time of Flight, TOF )的飞行时间不同而被检测。常用的基体有 2, 5二羟基苯甲酸 (2,5dihydroxybenzoic acid, DHB)、α-氰基-4-羟基肉桂酸(-Cyano-4-hydroxy-cinnamic acid,α-CAHC)和芥子酸 (sinapinic acid, SA)等[]。MALDI-TOF-MS可用于分子量的测定、肽质量指纹分析图谱的

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