高蛋白酶活性地衣芽孢杆菌热带菌种的筛选与鉴定..doc

文章编号：1674-7054（2010）02-0000-00 高蛋白酶活性的地衣芽孢杆菌热带菌种的 筛选与鉴定 陈圣丰1，林 钦2，周永灿1，欧阳吉隆1，王世锋1，谢珍玉1 （1海南大学 海洋学院海南省热带水生生物技术重点实验室海南 海口 570228；中国水产科学院 南海水产研究所；） 从海南文昌海口养殖和天然海域采集海水与底泥样品分离13株高蛋白酶活的地衣芽孢杆菌菌落形态标准生理生化16S rDNA测序，确定获得菌为野生型热带种地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）地衣芽孢杆菌高蛋白酶活性热带种筛选地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）能产生高效的胞外蛋白酶[1]、脂肪酶[2]淀粉酶[3]等生物活性物质。近年来，地衣芽孢杆菌作为一种生态制剂广泛应用于水产养殖业中，它和其他种类的芽孢杆菌、光合细菌等有益微生物共同作用，可有效改善养水质，促进养殖生物的生长和发育[45]。地衣芽孢杆菌为多种污水和有机物无害化处理的常用菌种，也是重要的蛋白改性和助消化的有益微生物，受到国内学者的广泛关注。如杜珍辉等将地衣芽孢杆菌工业菌株应用于猪粪液的无害化处理[9]李红梅等研究了丹麦的地衣芽孢杆菌菌株的碱性蛋白酶对玉米蛋白改性的作用[10]刘波等人研究了美国的地衣芽孢杆菌菌株对鱼类消化功能的影响[11]谢航等人研究了从福建土壤中分离的地衣芽孢杆菌对养殖水体中残余饵料的降解特性[12]涉及地衣芽孢杆菌的热带地理种群。从海南文昌海口水产养殖天然海域的海水底泥分离高蛋白酶活的鉴定和16S rDNA序列分析等方法，为热带养殖水质净化。 用于分离筛选芽孢杆菌的2008年12月和2009年5月从海南文昌、海口 收稿日期:2010-04-08 资助项目：2009GB2E200302）；科技人员服务企业项目2009GJE20024）；海南省重点科技项目（090501）；农业部渔业生态环境重点开放实验室和广东省渔业生态环境重点实验室开放基金（2007-10）. 作者简介：陈圣丰(1983–)，男，海南万宁人，海南大学海洋学院水产养殖专业2007级硕士研究生通作者：(1974–)，，海南大学海洋学院博士教授E-mail: xiezyscuta@163.com 市的天然海域中采集海水和底泥样品。对照菌株目前海南水产2种常见的分离。芽孢杆菌选择性培养基：胰蛋白胨 5 g.L-1、酵母浸膏 2.5 g.L-1、葡萄糖 1 g.L-1、琼脂13 g.L-1、NaCl 70 g.L-1、pH 7.5。普通海水液体培养基：酵母浸膏 1 g.L-1、牛肉膏 3 g.L-1、蛋白胨 5 g.L-1、NaCl 30 g.L-1，pH 7.5普通海水固体培养基：普通海水液体培养基加入琼脂 13 gL-1， pH 7.5。 固定液：10%的三氯乙酸染色液乙醇45 m、冰乙酸10 m、考马斯亮兰G-250 0.25 g、蒸馏水45 m。脱色液：乙醇50 m、冰乙酸75 m、蒸馏水875 m。 参考[6]方法芽孢杆菌选择性摇匀，取100 μL芽孢杆菌选择性培养基，50±1) ℃培养24 h，挑取表面粗糙、皱褶的乳白色单菌落为初筛的菌株。对底泥样品和加适量灭菌海水均匀，分离方法同上。 分别将初筛的目标单菌落接种于普通海水液体培养基，37 ℃培养24 h，按1：1比例80%无菌甘油加入保种管，-80 ℃长期保存备用，每株4管。 1.2.3 高蛋白酶活菌株筛选 制备：用接种环挑取初筛的目标菌株接种于普通海水液体培养基中，30 ℃ 180·min-1振荡培养24 h，6 000·min-1离心10 min，收集上清液各10 m，并用0.20 μm滤膜过滤除菌，-20 ℃保存备用。 脱脂奶平板法测定蛋白酶活配制含5%无菌脱脂牛奶的灭菌海水琼脂平板，用直径4 mm的打孔器打孔孔内20 μL目标菌株培养液。以等量的10 mg蛋白酶K和从中分离获得菌株的液阳性对照，无菌海水阴性对照30 ℃下孵育24 h10%三氯乙酸固定2 h，去除固定液后染色，直至平板培养基充分着色，去除染色液用脱色液充分脱色，使平板背景呈蓝色而水解圈为无色用游标卡尺测量水解圈直径。每个样品设个重复。 代培养：将具有菌株水解圈的Pb-WC09005，在高温50±1)℃，高盐NaCl 70 g.L-1的选择进行20代，测定第20代菌株的水解圈直径。每个样品设个重复。 采用统计软件SPSS（Statistical Program for Social Sciences）的方差分析法对实验数据进行显著性分析。 表型鉴定：以广东省微生物研究所的地衣芽孢杆菌ATCC11091和ATCC11946共株标准菌株作对照，测定各高蛋白酶活菌株的形态与生理生化特征，按[7]进行鉴定，并参阅[8]确定属或种。