黄酮抗氧化性的验证舜子.doc

黄酮抗氧化性的验证 实验目的 1、探索刺榆黄酮类物质是否具有抗氧化性。 2、探索刺榆黄酮类物质清除羟基自由基的活性。 二、实验原理 刺榆（ＨｅｍｉｐｅｅＩｅａｄａｖｉｄｉｉ），隶属于榆科（Ｕｌｍａｃｅａｅ）刺榆属（Ｈｅｍｉｐｔｅｌｅａ）．刺榆属仅刺榆一种．为单属种植物、早中生植物，具有耐干旱、耐瘠薄、耐盐碱、耐严寒、抗风沙、抗高温、寿命长、繁殖力强等特性，生于固定沙丘，是科尔沁地区重要的防风固沙树种。刺榆木材坚实，为制作农具、器具等优良用材．内蒙古东部的蒙古族在几百年前就有食用其嫩茎叶的习惯。据当地民间调查刺榆嫩茎叶具有降脂、滑肠和延年益寿的作用。据《本草拾遗》记载，刺榆性平味淡、涩．主要功效为解毒消肿．主治痈肿；叶治水肿，痈肿。痈疮肿毒主要用鲜树皮或根皮捣烂外敷。对水肿民间主要用刺榆嫩叶做羹食来治疗．韩国学者对刺榆心材的化学成分进行了系统研究。 黄酮类物质是人体必需营养素，人体自身不能合成，只能从食物中摄取。黄酮类化合物是从自然界各种植物中提取出来的，并且在植物界分布十分广泛【ｌ】。黄酮类物质具有抗肿瘤、抗氧化、降血压、降血脂等多种活性，因此对黄酮类物质的研究也越来越受到人们的关注ｆ１。１０１刺榆的黄酮类成分的研究却未见有报道，本文旨在探讨刺榆黄酮类成分抗氧化作用和降血脂功效。对民间的调查给出科学的依据。 实验仪器和试剂 １、材料 １．１试剂 丁化羟基苯甲醚（ＢＨＡ）、维生素Ｃ、２，２．偶氮．双．（２．脒基丙烷）氯化二氢（ＡＡＰＨ）、吩嗪硫酸甲酯（ＰＭＳ）（购自美国Ｓｉｇｍａ公司）ＮＡＤＨ（还原型辅酶Ｉ）、氮蓝四唑（ＮＢＴ）、ＣｕＳ０４、磷酸钠盐缓冲液、细胞色素Ｃ（ＣｙｔＣ）、硫脲。＂Ｉｒｉｓ．ＨＣＩ缓冲液、ＦｅＳ０４、三氯醋酸（ＴＣＡ）、硫化巴比妥酸（ＴＢＡ）、ＮａＣｌ、磷酸盐缓冲溶液（ＰＢＳ）、血脂康胶囊（北京北大维信生物科技有限公司产品）：胆固醇；丙硫氧嘧啶片：猪油；血清总胆固醇（ＴＣ）试剂盒、甘油三酯（ＴＧ）试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇（ＨＤＬ－ｃｈｏ）试剂盒和低密度脂蛋白胆固醇（ＬＤＬ．ｃｈｏ）试剂盒（均中生北控生物科技股份有限公司产品）。 １．２仪器 Ｐｏｌｙｔｒｏｎ电动匀浆器、离心机、分光光度计，摇床、ＦＣＡＮＦｌ２９００４型酶标仪。 １．３动物 ｗｉｓｔａｒ大鼠９０只，雄性，体重２２０－－２５０ｇ。 １．４刺榆黄酮的提取 将刺榆租粉加９５％乙醇在５５℃水域回溜提取８小时，将提取后的滤液过聚酰胺柱，分别用水和乙醇梯度洗脱，将乙醇洗脱液浓缩干燥后放入冰箱备用。 四、实验步骤 １、抗氧化测定方法 １．１体外大鼠脑匀浆脂质过氧化作用的测定 取正常大鼠的脑，剪成小块后，用Ｐｏｌｙｒｏｎ电动匀浆器，在冰冻Ｔｒｉｓ．ＨＣＩ缓冲液（２０ｍｍ０１．Ｌ．１，ｐＨ７．４）中，得到ｌ／１０匀浆。所得匀浆以１００００ｒ．ｒａｉｎ．１离心１０ｍｉｌｌ，将匀浆中的上清均分成１ｍＬ加到含有待测样品、１０ｇｒｎ０１．Ｌ．１ＦｅＳ０４和０．１ｍｍ０１．Ｌ．１维生素Ｃ的试管中，于３７℃保温ｌｈ．保温结束后，加入１．０ｍＬ三氯醋酸（ＴＣＡ，２８％）终止反应，再加入１．５ｍＬ硫化巴比妥酸（ＴＢＡ，ｌ％）．然后将此体系于１００１２加热１５ ｒａｉｎ。离心除去蛋白质沉淀后，于５３２ ｎｍ测定丙二醛（ＭＤＡ）．ＴＢＡ复合物的吸光度．ＢＨＡ（丁化羟基苯甲醚）作为阳性对照。待测样品的抗氧化活性以下式计算：抑制率（％）＝（Ａ．ＡＸ）／Ａｘｌ００％．其中Ａ为对照的吸光度，Ａ１含待测样品体系的吸光度。 １．２红细胞溶血的测定 针刺大鼠心脏采血，并收集于试管中。分离红细胞，用１０倍体积的Ｏ．１５ ｔ００１．Ｌ－１ＮａＣｌ洗涤３次，最后一次洗涤，将红细胞于２５００ｒ．ｍｉｎ．１．离心１０ｒｎｉｎ，得到完整的红细胞。 此分析体系采用过氧自由基造成红细胞溶血。以ｐＨ７．４的磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）制备１０％的红细胞悬液。在ｌｍＬ的红细胞悬液和待测样品中，加入等体积的２００ｍｍ０１．Ｌ－１ＡＡＰＨ（溶于ＰＢＳ）．于３７℃恒温水浴振荡２ｈ。然后将此体系以８倍体积的ＰＢＳ稀释，２５００ｒ．ｒａｉｎ．１离心１０ｒａｉｎ，于５４０ｎｍ测定上清液的吸光值Ａ。同样，将此体系以８倍体积的蒸馏水稀释，以达到红细胞完全溶血，并在５４０ ｎｌｎ测定上清的吸光值Ｂ．ＢＨＡ作为阳性对照。抑制溶血百分率按下式计算：抑制率（％）＝（１．Ａ／Ｂ）ｘ１００％． １．３羟自由基清除活性的测定 羟自由基清除活性的测定在维生素Ｃ．ＣｕＳ０４体系中，Ｃ＇ｕ２＋还原产生羟自由基，再根据羟自由基氧化细胞色素Ｃ（㈣的颜色反应进行测定．本实验采用３ｍＬ磷酸钠盐缓冲液（Ｏ．１５ ｍｍｏｌ?Ｌ广１，ｐＨ７．４）的羟自由基产生体系，其中含１００ｇｒｎ０１．Ｌ．１维生素Ｃ