酵母转化常用培养基及程序.doc

酵母实验操作方案 一．质粒酶切及线性化 1）用维特洁日常型小量DNA纯化试剂盒抽提9KSF2，可得到较纯的质粒10μg/3ml菌液，终体积80ul。 2）线性化质粒 使用80μl酶切体系 9KSF2质粒?????????????????? 70μl 内切酶（SacI， SalI， Bgl）???? 2μl 10 x buffer????????8μl 3）酶切3－16小时，一般3小时即可； 二．乙醇回收酶切质粒 1）2倍体积无水乙醇和0.1倍体积的3M NaAC（PH 5.2），混匀，沉淀DNA； 2）－200C数个小时（2小时），13,200rpm离心10～20分钟，吸弃上清； 3）300ul 70％乙醇洗一次，13,200rpm离心10分钟，吸弃上清（注意离心管位置，从含有DNA的离心管另一侧吸取）； 4）37烘干水分和残留乙醇； 5）用20μl ddH2O重溶； 6）1ul样品电泳检测DNA量，计算DNA总量； 三．电转化 1．准备感受态细胞 1）5ml YPD 接种GS115单菌落，250rpm，300C，摇菌24 hours； 2）100ml YPD，接种百分之一，同时留1ml空白YPD，300C ，250rpm，7～8hours，直到OD600＝1.3～1.5； 3）菌液转入500ml离心管，JA14，1500g，40C离心5 min，弃上清； 4）100ml冰水重悬，同上离心，弃上清； 5）80～90ml冰水重悬【50ml】，同上离心，弃上清； 6）20ml冰1M sorbitol 重悬【5ml】，然后转移到50ml 离心管中，同上离心，弃上清； 7）约150μl 1M sorbitol重悬【250ul】，40C备用，剩下的感受态细胞可以保存在－700C冰箱大约3周。2．转化 1)100μl GS115感受态细胞加入＋20μl 线性化质粒，用枪打匀； 2)冰浴5min，加入0.2cm转化杯中，轻轻将液体震到杯底，立即冰浴； 3)?电转化，参数设定：电压 1500V?? 电容 25μF?? 电阻 200欧姆，放电时间 4～5ms 4)立即加650μl 冰 1M sorbitol 入转化杯，打匀； 5)?迅速涂板，250μl/块 MD板，共3块； 6)?涂好的板放在300C培养箱中培养4～5天，至菌落直径1mm即可。注： a）【】内为手册推荐量，相关文献报道，转化效率一般为103～104 / ugDNA，所需质粒量0.3－10ug不等； b）放电是可好出现电击穿现象，原因有：酵母浓度不够；DNA溶液离子浓度过大；混合液体积不够； c）MD板加入1M sorbitol ，转化时第2）步冰浴时间延长至1－2小时，均有利于提高转化效率 四．G418筛选多拷贝基因 1）取出长有克隆的3块板，可考虑先挑10－20个菌落先表达； 2）第一块加入2ml 灭菌的ddH2o，用涂布棒打匀，洗后，菌液吸入第二块； 3）第二块加入1ml，洗之，吸入第三块； 4）菌液吸入EP管，可适量补充ddH2o； 5）混匀后取适量稀释约50倍，4ul×50＝200ul每块G418板，G418浓度从0.25－4.0mg/ml各一块； 6）注意涂布均匀，可适量补充ddH2o， 7）300C烘箱培养，2－5day，其余菌液可40C保存 注： a）手册推荐方法：第4）步将菌液转入EP管中，振荡5－10秒，用分光光度计测菌体密度，1OD600＝5×107 cells/ml, 取一定体积稀释至200ul/每块G418板, 涂布～105 cells；注意agar的存在会干扰分光光度计的读数。 五．表达： 1）从G418板挑单克隆入4ml/管MGY接种，300C，250rpm，2天左右至OD＝2－6，颜色乳白； 2）取1ml菌液于EP管中保种，余3ml菌液离心，1500g，5min，菌体换3ml BMMY，加千分之五甲醇，300ul/管； 3）每隔24小时加千分之五甲醇； 4）至表达之日起2天后每天取样80ul，留作电泳分析； 5）表达4天结束，1500g离心，5min，分别收集上清和沉淀； 6）上清用作蛋白分析，跑SDS电泳，Western Blotting分析，ELISA分析，样品浓缩，纯化分析等 附录一?? 培养基 LB： ???????????? Tryptone???????????? 10g??????? 1% ???????????? Yeast Extract???? ?? 5g????????? 0.5%????? ???????????? NaCl????????????????? ?? 5g????????? 0.5% ?????????