可溶性抗原的分离与纯化..doc

可溶性抗原的分离与纯化 1 引言 面对食品安全中出现的新问题和新挑战，各国和各地区出现了很多关于食品安全管理和控制的新观点新模式，为了满足这些新观点和新模式的要求，出现了很多与之相适应的食品安全检测技术和新方法，食品检测技术很多，其中生物学检测方法在其领域被广泛的应用，而在生物检测方法中免疫学方法应用较多，基本原理是利用抗体与抗原的特异性结合特性来实现食品中污染物检测的方法。 根据免疫学法的基本原理可知抗原的制备过程在此方法占据重要地位，抗原按照水溶性可分为不溶于水的颗粒抗原和可溶性胶体抗原，其中可溶性胶体抗原种类很多，主要包括蛋白质、多糖和细菌毒素等，这些物质可以存在于胞外和胞内，并且和其他的物质混合在一起，因此必须采取适当的方法进行分离和纯化，对于胞外抗原细胞只需要进行收集然后分离和纯化，而细胞内抗原则需要先将细胞破碎后再进行分离和纯化。 以蛋白质抗原为例分离纯化叙述如下： 2 纯化步骤 2.1细胞破碎 细胞破碎的方法主要分为机械破碎和非机械破碎法，机械破碎法包括研磨法和超声波破碎法，非机械破碎法包括酶溶法和化学渗透法。下面主要重点介绍一下超声波破碎法。 超声波破碎法器原理是利用超声波（10-20kHz）的机械振动使细胞破碎，超声波发生时的空化作用使得液体形成局部减压引起液体内部发生流动，漩涡形成和消失时，会产生很大的压力从而使细胞破碎。同时超声波振动也可以引起细胞原生质体内部的漩涡运动，产生切变力促使细胞破碎。超声波破碎法具体操作如下： 将待破碎的细胞和蒸馏水或缓冲盐按照一定比例混匀，这个比例需要根据具体实验来确定，太稀抗原有失活或变性的危险。太稠则破碎效率偏低。另外加入巯基化合物作为保护剂， 接通电源预热10min，将超声波发生器的探头插入被处理的细胞悬浮液中，注意探头不要接触到器皿壁，然后进行破碎。 连续处理样品时容易发生破坏抗原的情况，因此可至于冰域或每次停止1min以维持低温状态。 最后将溶液过滤或离心，取上层清液即为含抗原的溶液。 2.2细胞破碎程度的检查 检查细胞破碎的程度有两种方法，分别是测定释放蛋白质的含量和借助电镜直接观察和培养皿计算菌落的方法可以直观的看到细胞的破碎情况。 2.3蛋白质抗原的初步分离和纯化 一般情况下，目的蛋白质抗原含量都很低而且其中还混合着其他蛋白质、核酸和多糖等杂质，因此需要采用适当的方法尽可能的除去其他杂质，其方法有很多种应用较多的有(NH4)2SO4盐析法、有机溶剂沉淀法和聚乙二醇沉淀法。 2.3.1 盐析法 蛋白质是由氨基酸通过肽链连接形成的两性多价电解质。因此不同的蛋白质将在不同的(NH4)2SO4浓度下从混合物中析出，从而达到分离纯化的目的。此方法操作简便，(NH4)2SO4价格便宜、溶解度大、对蛋白质有一定的保护作用，可以除去大部分蛋白质杂质。 2.3.2 聚乙二醇法 聚乙二醇是高分子多聚物，其沉淀蛋白质的原理不是十分清楚，聚乙二醇法优于盐析法分段沉淀法，一次性可以处理大量的样品，因此近些年来被广泛采用，但是此沉淀法对小分子量的酶蛋白质效果较差。 2.3.3 有机沉淀法 在蛋白质溶液中加入有机溶剂可以降低溶液的介电常数，增加蛋白质分子电荷之间的相互作用，从而导致蛋白质的溶解度下降而析出。 2.4蛋白质抗原的进一步分离纯化 经过蛋白质抗原的初步分离和纯化大部分杂质已经被去除，经过适当的透析和浓缩后，有的可以直接用作免疫抗原，但是如果要研究抗分析原蛋白质的组成、结构、性质或者抗原决定簇的的组成和结构等则需要进一步分离和纯化，其方法主要采用色谱法，种类有离子色谱法、凝胶色谱法、吸附色谱法、亲和色谱法、高效液相色谱法以及近十几年才出现的径向色谱和电泳技术等。 2.5 本公司可提供的仪器 2.5.1 超声波细胞破碎仪 超声波细胞破碎仪 我公司生产的HUP系列超声波细胞破碎仪可以使两种（或两钟以上）不相溶液体混合均匀。因而能达到一般的机械搅拌或捣碎所达不到的效果。 主要特点：1．可储存5个控制模式。2．定时数字显示，输出能量由光条显示，0～100%连续可调，操作直观方便。 3．工作方式有间断（占空比由1%～100%可调）和连续两种选择，间断工作时，脉冲宽度和间断时间可分别设定。 4．工作时间可由数字定时器控制，达到预定时间自动转变为待机状态，定时范围1min～99min。5 .手持式超声波细胞破碎仪可人为自由控制工作和截止时间，使用灵活方便，适用于少量样品的处理工作。 2.5.2 菌落计数器 菌落计数 我公司生产的HCC系列菌落计数有以下优点： 1.半自动点击式计数。 2.可选择明暗视野背景。 3.内置平均数计算系统。 4.适用于任何探针式触笔。 5.归零功能，重力感应可调。 6.光学放大3X、6X。 7.LED照明，保护您的眼睛。 8.压力敏