牛奶中酪蛋白和乳糖的分离鉴定-武汉大学..doc

牛奶中酪蛋白和乳糖的分离、鉴定 杨宣乐 李玉钢 冒佳军 （化学与分子科学学院 武汉大学 武汉 430072） 摘要：本文介绍了从牛奶中分离酪蛋白和乳糖的方法，酪蛋白可用茚三酮反应，缩二脲反应及蛋黄颜色反应鉴定。同时运用醋酸纤维素膜电泳法分离了酪蛋白种不同的蛋白质组分。 关键词：酪蛋白、乳糖、等电点、分离、醋酸纤维素膜、电泳 引言 牛奶中含有多种营养物质，包括蛋白质，碳水化合物，脂肪，矿物质和多种维生素等。牛奶中的蛋白质主要是酪蛋白。酪蛋白是含磷蛋白质的复杂混合物，在牛奶中以其钙盐形式存在，即酪蛋白钙。利用蛋白质在等电点时溶解度最小的特性，把牛奶的ＰＨ值调到酪蛋白的等电点(ＰＨ =4. 8)来沉淀分离酪蛋白。酪蛋白不溶于乙醇和乙醚，所以可用乙醇和乙醚将其中的脂肪洗涤除去。酪蛋白 牛奶中的糖主要是乳糖。乳糖是一种二糖。它是唯一由哺乳动物乳糖合成的糖，它是在乳腺中被合成的。乳糖是成长中的婴儿建立其发育中的脑子和神经组织所需的物质。乳糖也是不溶于乙醇的，所以，当乙醇混入水溶液中时,乳糖会结晶出来 ,从而达到分离的目的。 醋酸纤维素膜电泳是区带电泳的一个重要分支, 其支持介质醋酸纤维素膜有很多优点: ①对蛋白质样品吸附力小, 几乎没有“拖尾”现象, 分离区带狭窄清楚; ②由于亲水性小, 电泳时大部分电流由样品传导, 故分离速度快; ③灵敏度高, 最低可达含量仅5Lg 的蛋白质样品仍可清楚地分离; ④经透明化处理后可作光扫描测定和长期保存.故本实验采用此法分离酪蛋白中的不同蛋白成分。 材料与方法 实验仪器 电泳仪、醋酸纤维素薄膜、恒温水浴锅、抽气抽滤瓶、布氏漏斗、蒸发皿、烧杯50ml、100ml各一个、表面皿、天平、玻璃棒。 主要试剂 10%醋酸溶液、95%乙醇、乙醚、新鲜纯牛奶、精密PH试纸（PH=3~5）、碳酸钙、滤纸、1%CuSO4溶液、10%NaOH溶液、茚三酮溶液。 实验过程 2.3.1 酪蛋白的分离 取50ml新鲜牛奶于100ml烧杯中，在恒温水浴中加热至45℃，边搅拌边慢慢加入10%醋酸溶液, 使混合物溶液的PH 值分别为4. 8，4. 6此时析出絮状沉淀。用纱布过滤沉淀, 再用少量水洗涤沉淀2 - 3 次。(在滤液中立即加入5g 粉状碳酸钙, 并搅拌几分钟, 留作下面实验2.3.3用。) 把沉淀转移到烧杯中, 加入20ml 95 %的乙醇,搅拌后用布氏漏斗过滤,再用乙醇和乙醚的等体积混合液20ml 洗涤沉淀两次,最后用20ml 乙醚分两次洗涤酪蛋白,每次用搅拌棒搅拌在乙醚中的酪蛋白约10min ,并捣碎任何团块。将洗净的酪蛋白移至表面皿上，自然晾干后分别称重得1.4636克，1.3864克，产率 90.9% (牛奶的密度为1. 03g/ ml) 。 2.3.2 酪蛋白的鉴定（在酪蛋白分离后立即完成效果最好） 取少量酪蛋白颗粒于试管中，加入少量水溶解。 取10ml酪蛋白溶液，加入茚三酮溶液5滴，振荡，放入沸水浴中加热2分钟，溶液呈淡紫色。（茚三酮反应） 取10ml酪蛋白溶液，加入10% NaOH溶液2ml后，滴入1%CuSO4溶液1ml。振荡试管，溶液呈蓝紫色。（缩二脲反应） 取10ml酪蛋白溶液，加入浓硝酸2ml后加热，有黄色沉淀生成。再加入10%NaOH溶液2ml，沉淀为橘黄色。（蛋黄颜色反应） 2.3.3 乳糖的分离 将2.3.1中滤液用倾滗法倒至蒸发皿中，用蒸汽浴浓缩至5ml后，将热的混合物用布氏漏斗抽滤，除去沉淀的蛋白质和残余碳酸钙。加热滤液，在热的溶液中加入95%乙醇18ｍl，并继续加热，待其混合均匀后，趁热过滤，滤液应澄清。把滤液移至锥形瓶中，加塞，放置 一周，让乳糖充分结晶。抽滤，分离出乳糖晶体，并用冷的95%的乙醇水溶液洗涤产物，待其干燥后称重，得0.45g 。 2.3.4酪蛋白的醋酸纤维素薄膜电泳 配制巴比妥缓冲溶液1000ml（巴比妥钠13.6g，巴比妥酸 1.84g），注入电泳槽中，在槽两极间用滤纸架上电桥。将醋酸纤维素薄膜浸入缓冲溶液中，待其完全浸透后，取出用滤纸吸干表面的溶液。将配置好的酪蛋白溶液点样在薄膜毛面中央，在点样处用铅笔做上记号，同时标上正负极。将薄膜毛面朝下光面朝上，贴在滤纸上，正负极按标号取向。盖上盖子，平衡十分钟，使电流保持在2mA/条薄膜。通电30~45分钟，关掉电源，取出薄膜迅速在110℃烘箱中烘干。 将考马斯亮蓝0.06g，2.5g冰乙酸，2.5g无水乙醇定容于50ml容量瓶中，配成显色剂。将烘干后的薄膜置于显色剂中浸泡五分钟，取出后用乙醇洗涤薄膜上的显色剂。可以观察到薄膜上有两条明显的蓝色色带。表明酪蛋白中至少含有两种不同的蛋白成分。 3．结果与讨论 （由于在乳糖分离中操作失误，乳糖含量较低，无法做旋光测定，故2.3.3采用其他组的数据） 3.1