实验八酵母rna的提取和鉴定..doc

实验八 酵母RNA的提取和鉴定 一.实验原理 酵母核酸中RNA含量较多，DNA则少于２％。RNA可溶于碱性溶液，当碱被中和后，可加乙醇使其沉淀，由此即可得到ＲＮＡ制品。 二.试剂 1.干酵母粉。 2.2g／L氢氧化钠溶液。 3.乙酸。 4.95%乙醇。 5.5%磷酸。 6.浓氨水。 7. 3，5-羟甲苯试剂：取比重1.19HCll00m1，加入FeCl3·6H20100mg及二羟甲苯100mg，混匀溶解后，置于棕色瓶中，此试剂必须在临用前新鲜配制。市售的3，5-二羟甲苯不能使用，必须用苯纯化结晶l-2次，并用活性炭脱色方可使用。 8. 50g／L硝酸银溶液。 9.钼酸铵试剂：20ml水溶解2.5克钼酸铵，加5mo1/LH2SO430ml，用水稀释置100ml，此试剂可在冷处保存一个月不变质。 10.氨基萘酚磺酸：取195ml150g/LNaHCO3溶液(溶液必须透明)加入0.5克纯炼的氨基萘酚磺酸及200g／LNa2SO4溶液5m1。并在热水浴中搅拌使固体溶解(如不能全部溶解，可再加200g／LNa2SO4溶液，每次数滴，但加入量以1m1为限)，此为浓溶液，置冷处可保存2-3周。如颜色变黄时，须重新配制。 测定时，将上述浓溶液用蒸馏水稀释10倍． 注：市售的氨基萘酚磺酸为暗红色，可纯炼如下：在100m1热水(90oC)中溶解15克NaHSO4 及1克Na2SO4，加入l g商品氨基萘酚碱酸，搅匀使其溶解(少量杂质不溶)，乘热过滤，再迅速使其冷却。加1m1浓盐酸(12mol/L)，则有白色氨基萘酚磺酸沉淀析出。过滤并用水洗固体数次，再用乙醇洗涤，直至纯白为止。最后用乙醚洗涤，并将固体放置在暗处，使乙醚挥发。将此纯炼的氨基萘酚磺酸保存于黄色瓶中。 三.实验操作 1.RNA的提取：置1ｇ干酵母粉于50m1三角瓶中，加入2ｇ/L　NaOH溶液10ml，沸水浴加热30分钟，并经常搅拌。待冷却后加入乙酸数滴，使提取液呈酸性（石蕊试纸），离心10-15分钟(4000转／分)。将上清液倒入三角瓶中，加入95%乙醇5ml， 边加边搅。加毕，静置，待完全沉淀，离心l0分钟，即可得到核酸钠的白色沉淀。 2.核酸的水解：在含有核酸钠的离心管中加入5%磷酸4m1，用玻棒搅匀，于酒精灯加热至沸，1-2分钟即可。 3.取水解液，按下表所列程序分别鉴定核酸中的嘌呤碱、磷酸、核糖及脱氧核糖。 嘌呤碱的鉴定：取试管两只，分别标明测定管与对照管，依次加入下列试剂： 管号 水解液 5%H2SO4 浓氨水 50g/LAgNO3 测定管 对照管 20滴 —— —— 20滴 5滴使呈碱性 5滴使呈碱性 10滴 10滴 注：加浓氨水使呈碱性可用pH试纸检定。 加入AgNO3后，观察有何变化。静置5分钟后，再比较两管中之沉淀 磷酸的鉴定：取试管两支，分别标明测定管与对照管，然后依次加入列各试剂： 管号 水解液 5%H2SO4 钼酸铵试剂 氨基奈酚磺酸 测定管 对照管 10滴 —— —— 10滴 5滴 5滴 20滴 20滴 放置数分钟，观察两管颜色有何不同。 核糖的鉴定：取试管两支，分别标明测定管与对照管，然后依次加入下列各试剂： 管号 水解液 5%H2SO4 3，5-二羟甲笨 测定管 对照管 4滴 —— —— 4滴 6滴 6滴 将两试管放入沸水浴内加热10分钟，比较两管颜色。 脱氧核糖的鉴定：取两试管分别标明测定管与对照管，然后依次加入下列各试剂: 管号 水解液 5%H2SO4 二苯胺试剂 测定管 对照管 20滴 —— —— 20滴 30滴 30滴 将两管同时放入沸水浴内，10分钟后，观察两管颜色之差别。 上述成分的定量测定可参照“动物组织中核酸的提取及测定”  1