外源性蛋白在大肠杆菌中的高效表达.doc

提高外源性蛋白在大肠杆菌中的高效表达策略 ??????? 本世纪60至70年代对大肠杆菌的研究使之成为自然界中最普遍为人们所认识的生物体。大肠杆菌具有操作简单和能在廉价的培养基中高密度培养，它的这些特征加上十多年外源基因表达的经验使其在大多数科研应用中成为高效表达异源蛋白最常用的原核表达系统。尽管大肠杆菌有众多的优点，但并非每一种基因都能在其中有效表达。这归因于每种基因都有其独特的结构、mRNA的稳定性和翻译效率、蛋白质折叠的难易程度、宿主细胞蛋白酶对蛋白质的降解、外源基因和E.coli在密码子利用上的主要差别以及蛋白质对宿主的潜在毒性等等。大肠杆菌质粒稳定性、mRNA结构、密码子的偏爱性和宿主菌的生长状态等因素。在分析了国内外有关在原核系统中表达蛋白的实验资料的基础上，对在大肠杆菌中高效表达外源蛋白的策略所涉及的内容进行总结，以期有助于研究有效表达载体的构型构建表达质粒需要多种元件，需要仔细考虑它们的组合，以保证最高水平的蛋白质合成。理想的启动子具有以下特性：作用强;可以严格调控;容易转导入其他E.coli以便筛选大量的用于生产蛋白的菌株，而且对其诱导是简便和廉价的[]。在启动子下游是RBS，其跨度约为54个核苷酸，两端限定在?-35（±2）和mRNA编码序列的+19到+22之间[]。Shine-Dalgarno(SD)位点在翻译起始阶段与16S?rRNA的3’端相互作用[]。SD与起始密码子间的距离约为5-13bp，而且此区的序列在mRNA转录物中应避免出现二级结构，否则将会降低翻译起始的效率[]。在RBS的5’和3’端均为A丰富区。转录终止子位于编码序列的下游，作为转录终止的信号和组成发卡结构的保护性元件，阻止核酸外切酶对mRNA的降解，从而延长mRNA的半衰期。特异性的RNA聚合酶（ rnap ）特异性的RNA聚合酶（ rnap ）分辨出不同的启动子结构，优先启动推动者与序列研究有关基因表达的假设增强子启动子相互作用发生分子间。在E.coli中发挥作用的启动子很多。通常使用的可调控的启动子有Lac(乳糖启动子)、Trp(色氨酸启动子)、Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子) 、lPL (l噬菌体的左向启动子)、T7噬菌体启动子等。2?终止子? 在一个基因的3末端或是一个操纵子的3末端往往有特定的核苷酸序列，且具有终止转录功能，这一序列称之为转录终止子，简称终止子(terminator)。在原核生物中，转录终止有两种不同的机制。一种是依赖六聚体蛋白rho的rho依赖性转录终止，rho蛋白能使新生RNA转录本从模板解离它是一种环状hexameric蛋白质和ATP解旋酶的活动。nusg ，和nusb是附加因素终止进程。 rho依赖性终止rho与游离核糖体C 的 rho的ATP酶激活rho - mRNA的，并提供能量，rho能够在mRNA上向前移行;移行过程中是mRNA上的讯息进入六聚体另一种是rho非依赖性转录终止，它特异性依赖于模板上编码的信号，即在新生RNA中形成发卡结构的一回文序列区，和位于该回文序列下游4-9bp处的dA、dT富含区[]。贯穿启动子的转录将抑制启动子的功能，造成所谓的启动子封堵[]。这种效应可以通过在编码序列下游的适当位置放置一转录终止子，阻止转录贯穿别的启动子来避免。同样地，在启动目的基因的启动子上游放置一转录终止子，将最大限度地减小背景转录[]。同时对于大肠杆菌来说，翻译终止效率可因终止密码子及临近的下游碱基的不同而显著不同，对于UAAN和UAGN系列终止密码子下游碱基对翻译的有效终止的影响力大小依序为U＞G＞A、C。UAG极少被大肠杆菌利用，相比UAAN和UGAN，UAG表现了有效终止，但其后的碱基对有效终止的影响力为U＞G＞A＞C。 1．3抗终止子细菌中许多参与氨基酸生物合成的操纵子在其第一个结构基因的5’端含有转录衰减子。衰减子由特定操纵子的氨基酸产物调节。这样关联的带电荷tRNA的存在就会在核糖体剪切之后引导初始转录本中二级结构的形成。如果没有关联的带电荷tRNA，则会形成抗终止子结构，从而抑制终止子中发卡结构的形成和转录的终止[]。hutp是一种RNA结合蛋白表达的调节有关氨酸利用率的操纵子，有约束力顺式调控序列。它要求组氨酸和镁离子结合mRNA的表达。在研究中，证明了几个二价阳离子可调解hutp RNA的相互作用。最好的二价阳离子被锰，锌和镉，其次是镁，钴和镍离子，而铜离子， yb2 +和Hg2 +无效。在hutp RNA的互动表明金属离子调解蛋白质核酸相互作用mRNA的rho依赖性终止抗终止元件能使RNA?多聚酶越过核糖体RNA操纵子中的rho依赖性终止子即boxA[],从而达到抗终止子的作用。(attenuator)是在研究大肠杆菌的色氨