荧光光谱分析讲义.doc

荧光光谱分析 一、实验目的 了解荧光光谱的基本原理； 熟悉荧光光谱仪的基本原理和操作规程； 了解荧光光谱的基本分析方法。 二、 荧光光谱原理 分子吸收辐射后,使其价电子处于不稳定的激发态，随后以光的形式辐射出能量、这称为“光致发光”。在二次发光的发射过程中，最常见的两种光致发光是分子荧光(fluorescence)和分子磷光phosphorescence)。由测量分子荧光和磷光强度而建立起来的定量分析法称为分子荧光分析法和分子磷光分析法。在化学反应过程中，分子吸收反应释放出的化学能产生激发态物质，这种激发态物质发出的光辐射称为化学发光(chemiluminescence)。根据化学发光强度或发光总量来确定物质组分含量的分析方法称为化学发光分析法。化学发光分析、分子荧光分析和磷光分析统称为分子发光分析法。 2.1、荧光及磷光的产生原理 含有孤对电子n和π轨道的分子，吸收光能后产生π(π* 和n(π* 电子跃迁。在通常情况下，基态分子的电子自旋是配对的，净自旋S＝0，光谱项的多重性2S+1＝l，这种状态称为单重态。电子激发态的多重性也是2S+1。若有一个电子激发至高能轨道时，当S=0, 此时分子所处的状态就称为激发单重态；若—个电子激发至高能轨道，但S＝1时，即2S+l＝3，这种状态的分子就处于激发三重态。假若分子中含有奇数电子，则S＝1/2时，分子处于二重态。 在图111电子激发能级图中，处于激发态的分子可以有多种辐射形式去激发而回到基态。首先由于与同类分子或其它分子碰撞，损失一部分能量，产生无辐射跃迁。然后，若能态的多重性不变(激发单重态向基态单重态跃迁)所产生的辐射称为荧光。而能态的多重性改变(激发三重态向基态单重态跃迁)时产生的辐射称为磷光。由图11可知，吸收光谱的能级高于荧光光谱能级，荧光光谱能级又高于磷光光谱能级。所以，荧光波长较磷光短；荧光的寿命约为10-9～10-6s, 而磷光的寿命约为10-3～10s; 一般荧光在常温下即可以发射，但磷光必须在极低的温度下（液氮，-196oC）才可以发射。 2.2 荧光强度与浓度的关系 由荧光发生机理可知，荧光强度If由下式表示； If=φf ·Ia 式中：Ia为被荧光物质吸收了的光强；φf为荧光量子效率，φf＝发射荧光的分子数／激发的分子总数，亦称荧光量子产率。根据光的吸收定律，被吸收光的强度Ia为 Ia=Io-It=Io(1-It/Io) If=φf ·Io(1-eεbc) （11-2） 式中：Io---激发光的光强 It―透过光强度 ε－摩尔吸收系数 b－样品槽长度 c－样品浓度。 若Io固定，则If取决于式子（11-2）中的指数衰减项。将其指数项用级数展开得： 由于荧光分析中检测物质浓度c很稀，(11-3)可写成： If＝φf ·Ioεbc (11-4) 当工作条件一定时，式(11—4)中Io ε b 都为常数，则 If=kφfc 对于某种被分析物质及溶剂，φf也是常数，则 If=K c 此式为荧光定量分析的依据。 2.3 荧光、磷光与分子结构的关系 一、影响荧光、磷光强度的因素 分子发光过程可由图115所示，可由分子激发态的各种辐射过程的速率常数来讨论影响发光的因素。图中S，S*和T分别表示基态、最低受激单重态和三重态。kc和kc分别是受激单重态和三重态无辐射去激发过程的速率常数；kf和kp分别表示荧光和磷光发射过程的速率常数。kx为最低s*-T态无辐射过程速率常数。这样，荧光量子效率为： φf = (11-9) 若kc和kx远大于kf, 则φf将趋于0；显然，凡是能使kf值升高得因素均可增强荧光。 磷光量子效率取决于kx、kp、kc’, 可由下式表示： 一般来讲，kf和kp主要取决于分子结构，而受工作环境影响极小；而kc和kc则受发光环境的强烈影响；kx既受分子结构的影响，也在一定程度上受环境的影响。分子中S*－T态间的能量差ΔE影响着kx, ΔE越小，则kx越大，有利于激发态之间的转化，φP大，有利于磷光发射。 在实际工作中，荧光分子或磷光分子与溶剂分子及其它溶质分子相互作用，引起荧光强度或磷光强度降低的现象称为荧光熄灭或磷光熄灭现象。引起这种现象的一些物质叫熄灭剂。这种熄灭效应是由发光分子受环境作用而产生的。其原因很多，机理也很复杂。但主要是S*，T态发光分子与熄灭剂发生碰撞，由于碰撞作用使无辐射去激发速率kc和kc变大，因而产生熄灭现象. 显然，碰撞熄灭观象与温度、溶剂的粘度有关系。不难理解，升高温度，降低粘度，都将使发光熄灭作用增大。因此，低温磷光就是基于这一原理建立起来的。 二、分子发光与结构的关系 如果要使分子能够产生荧光或磷光，首先要求分子能够吸收紫外或可见光辐能。根据吸收定律，εmax大的物