食用菌菌种分离及保藏方法.doc

食用菌菌种分离及保藏方法食用菌是一种纯培养，而在自然界中食用菌的发育繁衍过程中，又与其他众多的微生物混杂在一起。人们有目的地从中将特定品种食用菌的菌丝体单独分离出来，并在此基础上将获得的菌丝体进一步纯化，该过程就称为菌种分离。为了获得单一、纯度高的菌种，目前生产上常用的方法主要组织分离、孢子分离以及基内菌丝分离法等。现将该3种菌种分离方法及保藏方法总结如下。 1菌种分离方法 1.1组织分离法 组织分离法是通过切取菌索、子实体、菌核的新鲜幼嫩的组织进行分离，以获取纯菌丝的方法，是最常用的菌种分离法之一。子实体、菌索等实际上就是双核菌丝的纽结物，具有很强的再生能力。因分离时所选择的材料不同，该方法又可分为菌索组织分离法、子实体组织分离法及菌核组织分离法。在实践中，子实体组织分离法是最有效、最常用的方法。但对于胶质菌，由于其子实体中所含的菌丝量比较低，如黑木耳、银耳等，利用组织分离培养难度较大。组织分离属于无性繁殖的范畴，能保持原菌株的特性，遗传稳定变异小，不仅适于孢子不易收集或萌发的食用菌，也适于稳定优良品种的遗传性[1]。 1.2孢子分离法 孢子分离法，是采取子囊果或子实体中成熟的子囊孢子或有性孢子萌发成纯菌丝，再进一步培养成菌种的方法。由此法可以获得强活性、短菌龄的菌丝，该方法的另外一个优点是分离得到的有性孢子兼有双亲的遗传特性，可用于杂交育种和选育新种中。只是孢子间不仅存在个体差异，还存在较普遍的自然分化现象，出现的变异较大，必须经过出菇试验后才能用于生产中[2]。对于产孢子的真菌，一般其分离法多采用孢子分离法。 1.2.1种菇选择与处理。在选择种菇时，选取个体典型、大小适中均匀、健壮无杂且成熟度8成的子实体。将选好的种菇的杂物去除，并切除菇柄，用75%酒精抹擦菇体，或用0.1%升汞浸泡1 min（银耳、木耳类胶质菌的子实体只能用无菌水多次冲洗）。然后用无菌水冲洗种菇表面的残留药液。用无菌纱布拭干表面水分，并放入灭菌的器皿内备用。 1.2.2孢子采集。根据采集孢子的方法不同，又可分为以下几种。在用弹射法时，先安装已灭菌的孢子采集器，将经过处理的种菇菌褶朝下固定于三角架（采集器上）之上，扣上罩子，接着用0.1%升汞溶液润湿纱布并铺在培养皿的四周，既能防杂菌污染，又能增加罩内的湿度。最后再将整个采集器用灭菌的纱布覆盖，在适温漫射光条件下培养12~ 20 h，待孢子散出，选择在无菌的条件下将落有孢子的培养皿进行培养[3]。钩悬法是银耳、木耳等无菌柄类食用菌生产上常用的孢子采集法。取一金属针两头做成钩状，经火焰灼烧后一端固定于锥形瓶上，另一端钩住食用菌的子实体，塞上棉塞，于无菌环境中室温搁置约2 d，见瓶底有落下的孢子，即除去悬钩和子实体备用[4]。孢子收集的方法有很多，除了上述方法外，还有贴附法、印模法等。 1.2.3孢子分离。孢子分离有2种，分别为多孢分离和单孢分离，都是先收集孢子再经过分离选择，最终制成可供生产使用的菌种。其中多孢分离在生产使用较为普遍，如银耳、香菇、黑木耳等异宗结合的食用菌，它们的孢子有性别之分，单个孢子生产的菌丝无法结菇，因此需要把多个孢子接种在同一培养基上，发菌丝后自然交配，经挑选得到纯种，该操作简单易行。而蘑菇、草菇等孢子无性别区分，结实能力较强，单个孢子萌发即获得纯菌种。但生产上使用的食用菌同宗结合的种类相对较少，因此单孢分离多用于育种，生产上很少采用[5]。 1.3基内菌丝分离法 从食用菌生长基质中分离选择获得纯菌种的方法叫基内菌丝分离法。如可利用菇木、耳木、菌棒及土壤等作为分离材料进行分离。此法操作较复杂，但适宜不易采得子实体、错过子实体发生时期的菌类或胶质菌的菌种分离。使用此法时要特别注意，干燥耳木或菇木中的菌丝多处在休眠期。接种后有时需恢复25~30 d才能断定菌丝是否能恢复活性。 2纯化培养 菌种分离获得的菌丝体，经纯化后方能用于研究以及生产中。纯化的操作如下：若菌丝正常萌发，在洁白浓密菌落的生长前端挑取部分菌丝，接种于合适的培养基，并在室温下进行培养。如此移接2～3次后，纯化培养的目的即可达到。菌种纯化后的另一个重要工作就是做好菌种保藏[2]。 3菌种保藏方法 菌种保藏就是根据所保藏菌种的生理生化特性和遗传稳定性，人为地创造一个有助于休眠的环境条件，保持其稳定的性状。同时，还要保持菌种的纯培养状态，以使其免受到杂菌的污染。绝大多数菌种贮藏法都是通过人为的方式进行控制，最大限度地降低菌丝体的代谢强度，可通过低温、干燥、缺氧和饥饿等手段[6]。常见的方法有：一是矿油保藏法。为了有效地防止水分的蒸发，斜面培养物应用矿物油进行覆盖，同时还可起到隔绝空气的作用，进而降低细胞的生理代谢活动，该方法的储藏温度在15~25