如提取DNA分子时应去除RNA反之亦然.PPT

核酸提取操作与含量测定 找答案…… 核酸分离提取的原则是什么？要达到哪些要求？ DNA和RNA提取总需要注意的要点有哪些？ 核酸如何定量测定，简单说说它们的依据呢？ 前言 ③ 防止核酸的生物降解。细胞内或外来的各种核酸酶水解核酸链中的磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构。 其中DNA酶需要金属二价阳离子Mg2+，Ca2+的激活，因此使用金属离子螯合剂，如EDTA或柠檬酸盐等基本上可以抑制DNA酶的活性 而RNA酶不但分布广泛、极易污染样品，而且耐高温、耐酸碱、不易失活，所以生物降解是RNA提取过程中的主要危害因素； 高温，如长时间煮沸，除水沸腾带来的剪切力外，高温本身对核酸分子中的某些化合键也有破坏作用。 核酸提取过程中常规操作温度为0～4℃以降低核酸酶的活性从而减少对核酸的生物降解。 DNA提取的几种方法 DNA提取的几种方法 基因组DNA－ CTAB法 CTAB提取缓冲液的经典配方 基因组DNA－ CTAB法 基因组DNA－ CTAB法 基因组DNA－SDS法 基因组DNA－SDS法 基因组DNA－其它方法 　物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法 　化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法 　生物方式：酶法 基因组DNA－其它方法 　吸附材料结合法： 基因组DNA－其它方法 　浓盐法： 　　　　　　 　 　有机溶剂抽提法： 　　　　 　 　密度梯度离心法： 　　　　　　　 细胞器DNA－差速离心法 DNA提取的基本步骤 材料准备 细胞裂解 核酸分离、纯化 核酸分离、纯化 核酸分离、纯化 核酸分离、纯化 核酸沉淀、溶解 DNA提取常见问题 DNA提取常见问题 DNA提取常见问题 RNA提取的通用方法 　异硫氰酸胍/苯酚法 影响RNA提取的因素 影响RNA提取的因素 RNA提取常见问题 RNA降解 RNA降解 OD260 /OD280 比值偏低 苯酚残留： 不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。 解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。 OD260 /OD280 比值偏低 电泳带型异常 下游实验效果不佳 DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质 DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应 DNA中残留有金属离子 重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质（具体方法见前） 重新沉淀DNA，让酒精充分挥发 增加70％乙醇洗涤的次数（2-3次） 问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。 原因 对 策 材料不新鲜或反复冻融 未很好抑制内源核酸酶的活性 提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断 外源核酸酶污染 反复冻融 尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融 液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液 在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量 细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔 所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌 将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融 问题二：DNA降解。 对 策 原因 实验材料不佳或量少 破壁或裂解不充分 沉淀不完全 洗涤时DNA丢失 尽量选用新鲜（幼嫩）的材料 动植物要匀浆研磨充分；G＋菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁 高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加PK的用量） 低温沉淀，延长沉淀时间 加辅助物，促进沉淀 洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒 问题三：DNA提取量少。 对 策 原因 RNA提取的通用方法 　异硫氰酸胍/苯酚法 原理： 细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放； 释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离； 有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净RNA。 步骤: 材料准备：尽量新鲜。 裂解变性：异硫氰酸胍。使细胞及核蛋白复合物变性，释放 RNA，有效抑制核酸酶。 纯化分离：苯酚，氯仿，异戊醇。苯酚/氯仿可抽提去除杂物。 洗涤：70％乙醇。 沉淀：异丙醇、无水乙醇。 乙酸钠（pH4.0）：维持变性的细胞裂解液的pH值，沉淀RNA 此外还常用氯化锂选择沉淀RNA。 影响RNA提取的因素 材料： 新鲜，切忌使用反复冻融的材料 如若材料来源困难，且实验需要一定的时间间隔。可以先将材料贮存在TRIzol或样品贮存液中，于－70℃或－20℃保存 如要多次提取，请分成多份保存 液氮长期保存，－70℃短期保存 影响RNA提取的因素 样品破碎及裂解： 根据不同材料选择不同的处理方法： 培养细胞：通常可直接加裂解液裂解 酵母和细菌：一般TRIzol可直接裂解，对于一些特殊的材料可先用酶或者机械方法破壁 动植物组织