细胞因子对HSCT6细胞DCNmRNA表达的影响.doc

　　细胞因子对HSCT6细胞DCN mRNA表达的影响 【摘要】 目的: 探讨细胞因子对核心蛋白聚糖（D） mRNA 表达的调节作用。方法: 以HSCT6细胞为研究靶细胞, 选择血小板衍生生长因子（PDGF）、 IFN、 TNFα和IL6, 通过RTPCR技术观察这些细胞因子对HSCT6细胞D mRNA表达的影响。结果: IFNγ在108～109 U/L浓度能抑制HSCT6细胞增殖和增加D mRNA 的表达, 而IFNγ在105～106 U/L浓度时使细胞D mRNA 的表达降低; TNFα在高浓度（50 nmol/L）能够使 D mRNA表达减少; PDGF在10 μg /L和100 mL/L FCS培养条件下作用最明显; IL6使HSCT6细胞D mRNA水平下调。 结论: IFNγ和TNFα对D核心蛋白基因表达有双重调节作用, 这种调节作用发生在转录和转录后水平, PDGF对细胞增殖的调节与D 表达抑制相关。 【关键词】 核心蛋白聚糖（D） TNFα IFNγ PDGF IL6 众所周知核心蛋白聚糖（decorin, D）具有抗组织纤维化作用, 而细胞因子在对抗纤维化的形成机制中表现出重要而复杂的作用［1, 2］, 细胞因子是否能通过调节D的表达实现对抗肝纤维化的作用？其调节作用如何, 国内尚未见报道。我们通过RTPCR技术观察IFNγ、 TNFα、 血小板衍生生长因子（PDGF）和IL6对HSCT6细胞D mRNA 表达的影响, 旨在从免疫学角度探索肝纤维化 治疗 的新途径。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　大鼠肝星形细胞株HSCT6细胞为Mount Sinai医学院Friedman教授惠赠 。RPMI1640培养基购自Gibco BRL公司。rhTNFα、rhIFNγ和 rhPDGFBB购自美国RD公司。RNA抽提试剂盒购自德国QIAGEN公司。PCR扩增仪购自TECHNE公司。紫外凝胶成像分析系统型号VL为法国VILBER公司产品。 　　1.2 方法 　　1.2.1 细胞培养 　　HSCT6细胞50 mL/L CO2、 37℃孵箱中培养, RPMI1640含100 mL/L热灭活新生牛血清。细胞密度为0.1×106～1×106, 每2～3 d传代1次, 取对数生长期细胞用于实验。 　　1.2.2 细胞处理 　　取对数生长期细胞, 调整细胞密度为1×108/L, 接种于50 mL培养瓶, 5 mL/瓶。18～20 h换含10 mL/L FCS RPMI1640培养液, 继续培养20～24 h使细胞静止; 分组换液, 换含100 mL/L FCS RPMI1640 培养液, 同时加入不 同种类、 不同浓度的细胞因子, 对照组只加培养基不加细胞因子。培养24 h后收集细胞并抽提总RNA。 　　1.2.3 总RNA抽提 　　用德国QIAGEN公司试剂盒抽提, 按说明进行操作。将细胞先用冷PBS洗涤、 胰蛋白酶消化、 收集, 然后抽提总RNA。对所得样品RNA经紫外分光光度仪进行浓度及纯度测定, -70℃保存。 　　1.2.4 RTPCR扩增 　　2 μg总RNA加入25 μL反转录体系中, 42℃ 1 h, 94℃ 3 min终止反应。取2.5 μL反转录产物加入PCR反应体系中, 在PCR仪中进行反应。扩增反应参数如下: 94℃ 30 s, 60℃ 30 s, 72℃ 50 s, 35个循环。PCR扩增产物保存于-20℃。 　　1.2.5 结果观察和分析 　　电泳观察特异性条带并进行PCR相对半定量分析。取RTPCR产物10 μL上样于15 g/L琼脂糖凝胶（含EB）, 70 V电泳30 min, 用法国VILBER凝胶成像仪对特异性电泳条带进行观察和分析。各样本用同一标本的βactin 密度值校正。 　　2 结果 　　2.1 不同血清浓度时D mRNA 的转录 　　在低血清浓度条件下D mRNA转录表达量高于在高血清浓度条件下的转录, 以2 mL/L FCS转录较高（ 图1）。 　　2.2 PDGF在不同血清浓度中对D mRNA表达的影响 　　PDGF在100 mL/L FCS条件下与HSCT6细胞作用24 h, D mRNA表达明显被抑制, 低浓度血清中无明显影响（图1）。 　　 　　3 讨论 与肝纤维化发生有关的细胞因子主要是一类由炎症或纤维化部位的有关细胞合成和分泌的, 作用于靶细胞特定受体发挥局部生物学效应的因子。国内外资料和本室前期的研究发现, 肝纤维化时PDGF等水平及其受体均有不同程度的改变。 　　IFN可从转录水平抑制成纤维细胞合成胶原, 对抗组织纤维化［3, 4］。本研究中我们发现, IFNγ在1