肥胖抑制素对大鼠心室肌细胞收缩及L型钙通道的影响.doc

　　肥胖抑制素对大鼠心室肌细胞收缩及L型钙通道的影响 ：孙强，胡浩，周筠，于小江，臧伟进，陈晨 【摘要】 目的 探讨肥胖抑制素(obestatin)对心肌细胞收缩、细胞内钙瞬变及细胞膜L型钙通道的影响。方法 采用单细胞收缩/荧光边缘探测系统及全细胞膜片钳技术观察obestatin对急性酶解分离大鼠心室肌细胞收缩及钙信号的影响。结果 10-7mol/L obestatin增强大鼠心室肌细胞收缩幅度[(26.43±6.13)%]及细胞内钙瞬变幅度[(21.33±4.73%)]，并增强ICaL峰值。结论 Obestatin开放心肌细胞膜上L型钙通道，促进钙内流，增强大鼠心室肌细胞ICaL及细胞内钙瞬变，进而增强大鼠心肌细胞收缩。 【关键词】 obestatin;心室肌细胞;钙瞬变;L型钙电流 　　ABSTRACT: Objective To study the effects of obestatin on the contraction, calcium transient and Ltype Ca2+ current (ICaL) in rat ventricular myocytes. Methods The extent of contraction and Ca2+ transient changes otion edge detection system, and Ltype Ca2+ current p technique. Results Obestatin of 10-7mol/L increased the contraction amplitude of ventricular myocytes (26.43±6.13)% and Ca2+ transient amplitude (21.33±4.73)%, and enhanced ICaL peak. Conclusion Obestatin can strengthen contractility through increasing ICaL and Ca2+ transient in rat ventricular myocytes. 　　KEY 购自美国Invitrogen公司，obestatin购自澳大利亚Alexis Biochemicals公司。其他试剂均购自Sigma公司或Merck公司。 　　正常台氏液(mmol/L)：NaCl 136.9，KCl 5.4，MgCl2 1.0，HEPES 10，NaH2PO4 0.33, glucose 10.0，pH用NaOH调至7.4;KB液(mmol/L)：KCl 25;taurine 20;Lglutamic acid 70;KH2PO4 10;MgCl2 3.0;EGTA 0.5;glucose 10;HEPES 10;pH用KOH调至7.35;记录钙电流细胞外液(mmol/L)：NMDG 136, CsCl 5.4, MgCl2 1.0，CaCl2 2.0，NaH2PO4 2.0，glucose 10，HEPES 10，pH用NMDG调至7.3;记录钙电流电极内液(mmol/L)： CsCl 20，cesium aspartate 110，MgCl2 1.0，HEPES 10，EGTA 10，GTP 0.1，MgATP 5;pH 用CsOH 调至7.2。 　　1.3 方法 　　1.3.1 单个心室肌细胞的分离 常规酶解法分离成年大鼠心室肌细胞[3]。 其步骤简述如下：戊巴比妥钠(40mg/kg，ip)麻醉后大鼠，迅速开胸取出心脏并固定于Langendorff灌流系统。经主动脉灌流(37℃)含氧无钙台氏液，心脏停跳后，换以含0.5g/L胶原酶Ⅱ和1g/L牛血清白蛋白(BSA)的无钙台氏液灌流约18min，待心脏变松软，灌流液流出速度明显加快后再以KB液灌流冲洗残留酶液约3min。去除心房及主动脉并将心室组织置于含氧KB液中，将心室组织剪碎，以粗头吸管轻轻反复吹打并经 250目筛网过滤细胞悬液，室温静置30min后复钙备用。 　　1.3.2 心肌细胞收缩的检测 心室肌细胞收缩采用IonOptix单细胞动缘探测系统(IonOptix 公司, 美国)同步检测心肌细胞收缩及钙瞬变[6]。将心肌细胞置于倒置显微镜(Nikon)载物台上的细胞灌流小室内，以含氧台氏液(2mL/min，22℃)灌流。给予0.5Hz，5ms 波宽的电场刺激，场刺激由灌流槽两侧镶嵌的铂电极产生，细胞收缩影像通过40×物镜传输到IonOptix的MyoCam照相系统并呈现在监视器上。心肌细胞肌小节收缩幅度和收缩/舒张速度等指标由 计算 机自动实时采集并记录。选取细胞边缘折光性好、横纹清晰、无自发收