肿瘤坏死因子α对背根神经节电压门控性钠通道表达的影响.doc

　　肿瘤坏死因子α对背根神经节电压门控性钠通道表达的影响 ：臧颖 何昕华 庞瑞萍 魏绪红 信文君 周利君 李永勇 刘先国 【摘要】 【目的】 探讨肿瘤坏死因子α(TNF-α)对背根神经节(DRG)电压门控性钠通道(Nav1.3)表达的影响，并探讨其在神经病理性疼痛形成中的可能作用。【方法】 采用免疫荧光组织化学方法和免疫荧光细胞化学方法，观察外源性重组TNF(rrTNF)对在体大鼠和离体培养的大鼠DRG神经元Nav1.3表达的影响。【结果】 ①不损伤任何神经，仅在大鼠坐骨神经周围给予100 pg/mL 的rrTNF可引起病理性疼痛的产生，并引起L5和L4 DRG神经元内Nav1.3显著上调;②在分离培养的正常成年大鼠DRG神经元表面直接给予100 pg/mL rrTNF显著诱导Nav1.3表达上调，其上调分布于DRG神经元的胞膜和胞浆，并以胞膜上调更为显著。【结论】 TNF-α在神经病理性疼痛形成中具有重要作用，外周神经损伤可能通过DRG内TNF-α的上调，促发Nav1.3异常表达，由初级感觉传入异常兴奋，参与病理性疼痛的产生。 【关键词】 肿瘤坏死因子-α; 钠通道; 背根神经节; 病理性疼痛 　Abstract： 【Objective】 To discuss the effect of TNF-α on the expression of tetraodontoxin-sensitive Nav1.3 channels in dorsal root ganglion (DRG) and further to explain the mechanism resided in the development of neuropathic pain. 【Method】 -7：00 PM。为尽量减轻动物在实验中的痛苦，所有实验步骤均按照实验动物的相关使用原则操作。 　　1.2 慢性坐骨神经周围给予rrTNF模型(PST model) 　　此模型是在大鼠清醒状态下，通过导管在其坐骨神经周围反复多次给予rrTNF得以实现。如图1所示，大鼠在4 g/L 戊巴比妥钠 (40 mg/kg) 腹腔注射麻醉下，左后肢背侧经备皮、消毒后，沿坐骨神经走行方向做一斜向中线的斜行切口，用玻璃分针小心分离出后肢中段水平的坐骨神经，将一端连有PE-10导管(6 cm)的无菌明胶海绵(15 mm × 5 mm × 9 mm) 包裹于已分离出来的坐骨神经周围，并将导管固定于周围肌肉上，用3-0医用缝合线逐层缝合切口，暴露于切口外的导管埋置于皮毛中，通过导管分别于手术中及术后1、2 d给予200 ?滋L rrTNF或假手术组仅给予200 ?滋L rrTNF的溶剂—— 1 g/L牛血清白蛋白(bovine serum albumin， BSA)盐水，给药结束后用烧热的镊子封闭管口。 　　1.3 免疫组织化学 　　1.3.1 动物灌注和标本处理 　　大鼠在按实验设计饲养规定的时间后，用乌拉坦(氨基甲酸乙酯，1.5 g/kg)腹腔注射麻醉，先后用生理盐水和40 g/L多聚甲醛溶液(pH 7.2 ～ 7.4， 4 ℃)对动物进行主动脉灌流固定30 min。解剖动物取出同侧L4和L5 DRG，多聚甲醛溶液后固定3 h，再于300 g/L蔗糖溶液中脱水3 d。标本经冰冻切片后收集于24孔板内，并置于4 ℃冰箱短暂保存。具体实验方法参见我们的近期报道[7]。 　　1.3.2 免疫荧光组织化学染色及定量分析 　　将DRG冰冻切片用0.01 mol/L PBS洗3次，每次5 min，加入封闭液1 h，吸去封闭液并加入抗-Nav1.3抗体(1：100;Sigma， St. Louis， USA)。4 ℃过两夜后，吸去一抗，加入标记Cy3的IgG(1：300;Jackson ImmunoResearch， PA)，避光作用1 h后贴于载玻片上，于荧光显微镜下观察并拍照。免疫染色结果的定量分析是通过计数每张切片上的Nav1.3 免疫活性(Nav1.3 immunoreactivity， Nav1.3-IR)阳性细胞的百分比获得的。具体实验方法和定量分析参见我们的近期报道[7]。 　　1.4 成年大鼠DRG神经元的分离培养 　　正常雄性SD大鼠，麻醉、低温下，迅速取出腰骶部脊柱，尽量剪净脊柱两侧的肌肉组织。把脊柱从正中剪开，分成左右两半，放入解剖液中(DMEM液)。从解剖液中取出脊柱，用镊子取出脊髓，轻轻取出双侧椎间孔中的L4、L5、L6 DRG放入含解剖液的培养皿中。用巩膜剪剪除DRG上的神经根，吸干培养皿中的解剖液，尽量剪碎DRG。然后将剪碎的DRG放入消化液(1.25 g/L胰酶 + 1.25 g/L胶原酶) 37 °C振荡消化15 ～ 20 min，加入血清终止消化。静