胃肠舒片对大白鼠胃肠平滑肌细胞线粒体跨膜电位的影响.doc

　　胃肠舒片对大白鼠胃肠平滑肌细胞线粒体跨膜电位的影响 【摘要】 　　目的 研究胃肠舒片对大白鼠胃肠平滑肌细胞线粒体跨膜电位的影响。方法 胃肠平滑肌细胞离体培养，分为5组：空白对照组、西沙必利组（0.51 mg/ml）、胃肠舒Ⅰ组（25 mg/ml）、胃肠舒Ⅱ组（50 mg/ml）、胃肠舒Ⅲ组（75 mg/ml），采用CelltiterGloTM法和若丹明荧光法分别检测了胃肠舒片对大白鼠胃肠平滑肌细胞ATP和线粒体跨膜电位的的影响。结果 胃肠舒片作用24 h后与对照组和西沙必利组相比能显著增高平滑肌细胞ATP的含量（Plt;0.05），随着胃肠舒用药浓度的增高ATP的含量也增高；流式细胞仪结果表明胃肠舒明显加大了胃肠平滑肌细胞的线粒体跨膜电位，并且随着胃肠舒用药浓度的增高，跨膜电位也增高。结论 胃肠舒可能通过改变胃肠平滑肌细胞线粒体的跨膜电位促进了胃肠运动。 【关键词】 中药胃肠舒片　ATP　线粒体跨膜电位 　　【Abstract】 Objective To study the effect of ethods Gastrointestinal smooth muscle cells al medium.②Cisapride group: cultured in normal medium g/ml Cisapride.③ itochondrial potential ine fluorescence (R123) technique. Results After exposure to EM培养基购自Gibco公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料公司； Rhodamine(若丹明)123购自 Sigma公司；CellTiterGloTM 试剂盒购自Promega公司；Labsystems Multiskan MS酶标仪；HERA CO2培养箱；CK×41倒置显微镜、IX71荧光倒置显微镜购自OLYMPUS； EPICS XL流式细胞仪购自美国贝克曼库尔特公司。 　　1.2 方法 　　1.2.1 离体胃肠平滑肌细胞的培养：选择标准SD大白鼠，体重180～200 g，雌雄各半，乙醚麻醉，剖腹后迅速剪取胃体、空肠组织，PBS清洗后剪碎，去除上清液，重复清洗2～3次。将盛有组织碎片的容器置于冰上，去除残留的上清液，加入0.25％胰蛋白酶，在4 ℃孵育6～18 h。移弃组织碎片中的胰蛋白酶，在37 ℃孵育包含残留胰蛋白酶的组织碎片20～30 min。待小块组织完全消化溶解后，过200目网，1 000 r/min离心7 min。弃上清液，向细胞沉淀中加入新鲜配制的20%胎牛血清DMEM培养液，轻轻吹打，后按每瓶(25 ml)3×104活细胞接种在培养瓶里，放入37 ℃孵箱里静置培养待测，CK×41倒置相差显微镜观察拍照。 　　1.2.2 胃肠平滑肌细胞的鉴定：将处理好的盖玻片，放入6孔板使之与孔底贴和紧密，进行细胞培养。细胞生长至第5天吸去培养液，先用PBS洗涤已贴壁盖玻片2～3次。95%酒精室温固定20 min，PBS洗2～3次。0.1% TritonX100室温孵育20～30 min增强细胞通透性。正常羊血清于37 ℃封闭20 min。滴加一抗兔抗鼠αactin单克隆抗体（1∶200，购自Sigma公司）室温过夜，滴加二抗羊抗兔FITCIgG（1∶100），37 ℃孵育2 h，倒置荧光显微镜（波长500 nm）观察。 　　1.2.3 胃肠平滑肌细胞实验分组：实验分为5组，分别为空白对照组、胃肠舒小剂量组Ⅰ组（25 mg/ml）、胃肠舒中剂量组Ⅱ组（50 mg/ml）、胃肠舒大剂量组Ⅲ组（75 mg/ml）、西沙必利组（0.51 mg/ml），每组6个复孔，各组药物作用24 h。 　　1.2.4 胃肠平滑肌细胞ATP含量检测：CelltiterGloTM 试剂盒A液和B液混合，室温下静置1 h。向96孔板的各孔细胞中每孔加入100 μl CelltiterGloTM混合液，5 min后酶标仪检测（波长562 nm）。 　　1.2.5 胃肠平滑肌细胞线粒体跨膜电位的检测：将待测胃肠平滑肌细胞离心1 000 r/min收集，PBS清洗2次，加入1 ml的终浓度为1 μg/ml 的Rhodamine123，放入37 ℃孵箱里静置培养45 min。PBS清洗2次，倾去原有液体。250 μl PBS重悬，缓慢加入-20 ℃乙醇750 μl，流式细胞仪检测（激发波长488 nm、发射波长525 nm）。 　　1.3 统计学处理 组间比较用方差分析，Plt;0.05为差异有统计学意义。 　　2 结果 　　2.1 光镜观察胃肠平滑肌细胞 倒置显微镜下观察可见细胞形状椭圆形，束状排列，密集与稀疏处相互交错呈“峰