血小板源性生长因子及胰岛素样生长因子对大鼠腰椎间盘退变的影响.doc

　　血小板源性生长因子及胰岛素样生长因子对大鼠腰椎间盘退变的影响 【关键词】 椎间盘； 退行性变； 血小板源性生长因子； 胰岛素样生长因子； 大鼠 椎间盘退变 (intervertebral disc degeneration，IDD)是下腰痛和腰椎间盘突出症的主要原因［1］，临床上的保守治疗和手术治疗效果均不甚理想［2］。随着生物化学、分子生物学的 发展 ，生长因子与IDD的关系备受国内外学者的关注［3］。血小板源性生长因子（PDGFs）作为一种人体内含量甚微而有多种生物学活性的多肽，对间充质的细胞有较强的促细胞分裂、促基质合成的作用，是体内重要的细胞因子之一。PDGFs具有多种生物学效应，在软骨形成以及代谢调节中起重要作用，有抑制某些有害刺激的凋亡诱导作用［4］。有学者在人退变腰椎间盘组织中用免疫组化方法测得PDGFs的存在[5]；另有学者在PDGFs干预下培养人椎间盘细胞，结果表明一定浓度PDGFs可以减少椎间盘细胞凋亡［6］。胰岛素样生长因子(IGFs)是一种低分子质量多肽,具有胰岛素样作用。其在体外培养条件下具有维持细胞表型、促进细胞外基质合成、抑制凋亡和促进细胞增殖作用［7］。动物实验［89］表明，IGFs具有明显抗凋亡作用，可刺激髓核细胞蛋白聚糖的合成，缩短有丝分裂时间，抑制MMPs的生成增加。以上结果提示，PDGFs及IGFs与IDD关系密切。本研究应用PDGFs及IGFs对大鼠IDD模型进行干预，通过免疫组化法观察Ⅱ型胶原改变、检测椎间盘蛋白多糖含量及流式细胞仪检测细胞凋亡率，探讨PDGFs及IGFs对大鼠腰IDD的影响。 1 材料和方法 1.1 动物和试剂 3月龄清洁级SpragueDag·kg-1）腹腔注射麻醉，俯卧位，固定四肢，背部备皮，消毒铺单。以L3为中心切除大鼠关节突、棘突及棘上棘间韧带，切断双侧竖棘肌，依层次缝合皮下筋膜、皮肤后放入单独笼中饲养。术后连续3 d每只大鼠予青霉素5万U肌肉注射。造模成功后大鼠随机分为6组，每组6只。随机选取其中两组作为PDGFs实验组，分别于造模当日及造模后1个月腹腔注射PDGFs（100 ng·kg-1），隔日1次，连续1个月；随机选两组为PDGFs加IGFs实验组，分别于造模当日及造模后1个月腹腔注射PDGFs（100 ng·kg-1）及IGFs（100 ng·kg-1），隔日1次，连续1个月；另两组为阴性对照组，分别于造模当日及造模后1个月腹腔注射等量生理盐水，注射频次及持续时间同前两组。36只大鼠全部存活，分别于术后1、2个月分批处死各组大鼠，立即取出腰椎，仔细剔除椎间盘周围肌肉，沿L3、L4、L5、L6椎体的上下终板完整取下L3～4、L4～5、L5～6椎间盘。L3～4、L5～6椎间盘标本置于超低温冰箱中分别留待检测蛋白多糖及作流式细胞仪检测用；L4～5椎间盘立即用蒸馏水冲洗3遍后置于10%多聚甲醛溶液中固定。实验过程中各批标本分别集中取材，标本的处理及检测等步骤均严格保持一致。 1.3 检测方法 1.3.1 免疫组化技术 取10%多聚甲醛溶液固定24 h的L4～5椎间盘，常规EDTA脱钙，石蜡包埋，按5 μm厚度连续切片5张。将30％H2O2 1 ml加入双蒸水10 ml,滴于组织块上，室温下10 min以灭活内源性酶；双蒸水洗玻片3次,滴加复合消化液于组织上，保持室温10 min后用双蒸水洗玻片3次以修复抗原，滴加5％BSA封闭液，室温20 min；将兔抗大鼠Ⅱ型胶原单克隆抗体按1∶50稀释(用双蒸水稀释)，放置于冰箱中4 ℃过夜；滴加生物素化山羊抗兔IgG,保持室温20 min；滴加试剂SABC于组织上，并保持室温20 min；DAB显色,苏木素复染1 min，自来水冲洗,脱水、透明及中性树胶封片。应用 计算 机图像分析系统及其软件(Simple PCI )评价呈阳性染色的髓核组织基质，自动计算其灰度值。 1.3.2 蛋白多糖检测 将超低温冰箱中保存的L3～L4椎间盘组织取出解冻后置入离心管中，加入3％NaOH 0.5 ml置于恒温振荡器中振荡3 h，温度控制在40 ℃；加入HCl约2 ml调整溶液pH值至8～9，加入100 mg·ml-1胰蛋白酶50 μl酶解消化2 h；将溶液按间三苯法测定蛋白多糖含量，结果以mg·（100 mg湿重）-1表示。 1.3.3 流式细胞术 将超低温冰箱中保存L5～L6椎间盘组织取出解冻后，用眼科剪剪碎至糊状，200目滤网过滤成细胞悬液，悬液中加入胰蛋白酶1.5 ml酶解消化约5 min；胎牛血清1.3 ml终止反应，1 500 r·min -1离心5 min后弃去上清液；加入1％ TritonX100摇匀后静置10 min；加入0.01％RNA酶酶解消化10 min后离心，弃去上清液；加入