补骨脂素加长波紫外线对HL-60细胞凋亡的影响.doc

　　补骨脂素加长波紫外线对HL?60细胞凋亡的影响 【摘要】 　　目的：探讨补骨脂素（psoralen, PSO）加长波紫外线（ultraviolet?A, UVA）的光化学疗法（PUVA）对人急性髓细胞白血病（FAB?M2）细胞株HL?60细胞凋亡的作用及部分作用途径。方法：以HL?60细胞株为研究对象，以0、10、20、40、80 μg/ml PSO加波长为360 nm的UVA，作用于HL?60细胞，通过流式细胞仪检测HL?60细胞在PUVA后的凋亡情况；电镜下观察细胞超微结构改变；荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）及流式细胞技术检测Fas配体（Fas ligand, FasL)在基因和蛋白水平的表达情况。结果：单纯PSO、单纯UVA照射及PUVA均可诱导HL?60细胞发生凋亡，PUVA的作用显著强于前两者。电镜下观察经PUVA处理后的HL?60细胞超微结构，可见明显的凋亡形态学改变。PSO、UVA照射及PUVA均可下调FasL在基因、蛋白水平的表达，PUVA的作用显著强于前两者。结论： PUVA可诱导白血病细胞HL?60发生凋亡，作用强于PSO及UVA照射。HL?60被PUVA诱导凋亡后FasL基因表达水平下调。 【关键词】 白血病 HL 60细胞 细胞凋亡 Fas配体 紫外线疗法 光化学疗法 补骨脂素 　　Methods: The HL?60 cells . The factorial design and analysis of variance ong the factors. 　　Results: PSO, UVA and PUVA all induced the apoptosis and the effects of PUVA icroscope. PSO, UVA and PUVA all decreased the expressions of FasL gene and protein. The effects of PUVA ia; HL?60 cells; apoptosis; Fas ligand; ultraviolet therapy; photochemotherapy; psoralen 　　补骨脂素（psoralen, PSO）是中药补骨脂种子中的主要成分，研究表明其具有光敏性质与抗肿瘤活性。本实验从中药补骨脂中提取出PSO，以不同浓度PSO加波长为360 nm的紫外线（ultraviolet?A, UVA）（简称PUVA），作用于HL?60细胞，通过流式细胞仪检测HL?60细胞在PUVA后的凋亡情况；电镜下观察细胞超微结构改变；荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）及流式细胞技术检测Fas配体（Fas ligand, FasL)在基因和蛋白水平的表达，以探讨PUVA法诱导HL?60细胞凋亡的作用及部分作用途径。 　　1 材料与方法 　　1.1 细胞株 人急性髓细胞白血病?M2型HL?60细胞株由大连医科大学惠赠。 　　1.2 药品及主要试剂 PSO由大连理工大学及中国人民解放军第210医院合作从中药补骨脂中提取和制备，用乙醇溶剂提取和配制，PSO浓度为5 mg/ml。二甲基亚砜（dimethyl sulphoxide, DMSO）购自北京化工厂。RPMI 1640培养液购自GIBCO公司。小牛血清购自杭州四季青生物材料工程公司。TRIzol购自美国GIBCO BRL公司。FasL基因检测试剂盒购自中山大学达安基因股份有限公司。鼠抗人FasL（CD95 Ligand）单克隆抗体试剂盒购自美国CALTAGTM Laboratories。 　　1.3 仪器和设备 EPICS XL型流式细胞仪由美国贝克曼库尔特公司生产，GLY?10型光量子血液平衡治疗仪由徐州华卫医疗设备公司生产，DA7600型荧光定量PCR仪由中山大学达安基因股份有限公司生产。 　　1.4 细胞培养 HL?60细胞常规培养于含15%小牛血清的RPMI 1640培养基（含硫酸庆大霉素0.025 U/ml）中，于37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中进行连续培养，每2～3 d换液1次。 　　1.5 实验分组 依据是否采用紫外线照射和PSO浓度不同将实验组分为HL?60细胞对照组、UVA照射组、PSO各浓度组及PUVA各浓度组，其中UVA照射时间为5 min。 　　1.6 流式细胞术测定PUVA 24 h后HL?60细胞凋亡的情况 取浓度为4.0×105/ml、处于对数生长期的HL?60细胞5 ml，分别加入PSO 0、10、20、40和80 μl，使PSO在反应体系中的终浓度分别为0、10、20、40、80 μg/ml，放入石英