针刺对脑缺血大鼠神经元凋亡的影响.doc

　　针刺对脑缺血大鼠神经元凋亡的影响 【关键词】 针刺;脑缺血;细胞周期;凋亡 　　ABSTRACT：Objective To investigate the effects of acupuncture on expression of CDK4 protein in neurons and neuronal apoptosis after focal cerebral ischemia reperfusion in rats.Methods A model of middle cerebral artery occlusion(MCAO) in rats inal filament occlusion.Acupuncture munohistochemistry,etry pus.Results A significant increase in CDK4 immunostaining and apoptotic neurons munoreactivity of CDK4 and apoptotic neurons betic group and acupuncture group ia reperfusin injury. 　　KEY CAO)再灌注模型的建立 　　参照Koizumi等[3]方法制作大鼠左侧大脑中动脉阻塞及再灌注模型。采用10%水合氯醛(0.3ml/100g)麻醉, 术中维持动物肛温(36.6±0.5)℃，颈部正中切口，分离并结扎左侧颈总动脉、颈外动脉,注意避免刺激迷走神经。从颈总动脉分叉处插入4.0丝线,沿颈内动脉进入距颈总动脉分叉处1.8～2.0cm略感阻力时停止;30min后拔出丝线进行缺血再灌流。术后在约20℃的空调环境下单笼饲养,自由进食、进水。对照组只暴露血管。 　　1.3 针刺方法 　　按照《实验针灸学》[4]，取水沟、内关、曲池、足三里4穴，强刺激手法，交替行针5min。再灌后开始，2次/d。 　　1.4 标本采集和处理 　　再灌48h后断头取脑，各组取6份-8℃冰箱冻存备用做in×4次,最后在暗室中进行化学发光法显影，高敏感胶片摄片、洗片。 　　1.6 免疫组化检测 　　3%H2O2孵育10min，0.01mol/L枸橼酸盐缓冲液(pH 6.0)中微波修复(96℃～98℃)10min, 自然 冷却至室温。正常血清封闭30min，倾去血清,滴加CDK4兔多克隆抗体，4℃孵育过夜。滴加生物素标记的二抗稀释液，滴加辣根酶标记的链酶卵白素稀释液,室温孵育45min，DAB显色至自来水终止。脱水、透明并封片。常规设立阴性对照。光镜下观察CDK4的表达,以胞浆胞核棕黄色着色的细胞为阳性表达的细胞。 　　1.7 凋亡检测 　　流式细胞计数检测凋亡：大鼠脑海马剪碎后以0.25%胰蛋白酶于37℃消化30min，以等量生理盐水终止消化，经200目筛网过滤,离心,以PBS洗2次,调整细胞数为1×106/ml,双标(PI, Annexinv)检测凋亡。 2.2 免疫组化结果 　　对照组CDK4蛋白有微弱表达，缺血组CA1、CA2和CA3区有较多CDK4蛋白表达，以CA1区最明显，染色明显加深，针刺后CDK4蛋白表达减少，染色明显减弱。(图2)　图2 大鼠脑缺血再灌注后2d损伤侧海马 　　2.3 流式检测凋亡结果 　　对照组凋亡细胞很少，脑缺血再灌后，细胞凋亡率(0.3758±0.0504)%显著升高(Plt;0.01)，针刺 治疗 后细胞凋亡率(0.2289±0.0446)%明显下降(Plt;0.05)，提示针刺能够抑制凋亡。(图3) 　　 3 讨 论 　　周期蛋白依赖性蛋白激酶4(CDK4)是真核细胞有丝分裂的重要亚基之一,它与细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)结合成Cyclin D1CDK4复合物,正向调节细胞周期,推动细胞周期进展。成体的神经细胞是失去分裂增殖能力的终末分化细胞。最近的研究发现部分CDKs和Cyclins出现在不可能进行增殖分裂的受损害的中枢神经细胞中,尤其Cyclin D1和CDK4倍受关注[5,6],在由NGF撤除或缺氧因素造成的体外培养成年大鼠交感神经细胞和成年兔脊髓神经细胞凋亡研究和脑创伤研究中[7],CDK4及其激活因子Cyclin D1同时在即将凋亡的神经细胞中表达,并且加入CDK4阻滞剂可以明显抑制神经细胞凋亡。Boutillier等[8]认为,细胞凋亡的某些阶段与细胞增生间存在某些相似性,细胞凋亡可能就是异常的有丝分裂。Timsit等[9]认为脑缺血后细胞周期蛋白的表达以其在凋亡机制中的作用为主,而不是在细胞周期中的作用,部分凋亡是由于细胞周期的异常调控所致。总之,细胞周期因子出现在不可能进行增殖分裂的缺血后中枢神经细胞，而不是发挥其在细胞周期中的作用,有可